基于噬菌体展示技术的山羊痘病毒受体的筛选与鉴定

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病。近年来，该病在我国呈蔓延趋势，给养羊业的发展造成极大的经济损失。但有关山羊痘病毒对宿主细胞的侵入过程和感染机制的研究还较少。本项目将噬菌体展示技术应用于山羊痘病毒受体研究，从感染初期病毒识别皮肤上皮细胞的表面受体这一关键环节入手，通过提取、分离和纯化山羊皮肤上皮细胞mRNA，构建噬菌体展示文库，用纯化的山羊痘病毒进行多轮筛选，富集与病毒有特异性结合的受体，进而获得其基因序列。应用免疫组化分析受体在组织细胞的分布。通过病毒在易感细胞上进行病毒-受体阻断试验、受体RNA干扰试验和在非敏感细胞上进行病毒受体重建及受体重建后的病毒感染试验来鉴定受体，最终为揭示山羊痘病毒的入侵机理、靶向治疗和预防提供理论基础。

病毒受体是指能特异性地与病毒结合促进病毒侵入的宿主细胞膜成分，其在特定细胞的存在与否是决定病毒能否感染该细胞的主要因素。为了筛选与GTPV有高亲和力并能特异性结合的病毒受体，本研究将噬菌体展示技术应用于GTPV受体研究，通过提取原代培养的山羊上皮细胞mRNA，反转录合成cDNA，将cDNA与噬菌体载体连接后进行体外包装，构建噬菌体展示文库。然后用纯化的GTPV对文库进行筛选，从中获得了三种能与病毒特异性结合的噬菌体，经序列分析发现其包含的基因片段分别与羊层粘连蛋白 gamma 2（Laminin gamma 2）蛋白、羊囊性纤维化跨膜传导调节蛋白和白细胞介素10受体同源，核苷酸同源性分别为96%、90%和88%。病毒-受体蛋白阻断试验表明Laminin gamma 2蛋白能一定程度上阻断病毒对易感细胞的感染；通过设计、筛选靶向Laminin gamma 2基因的RNA干扰片段，与山羊痘病毒共转染易感细胞—Vero细胞，能明显改变Vero细胞对山羊痘病毒的易感性；在病毒非敏感细胞(Marc-145)上通过基因整合将Laminin gamma 2基因整合到其基因组并获得重组细胞系，对其进行病毒感染，结果显示病毒对重组细胞感染性明显增强。本项目的研究结果表明，Laminin gamma 2在山羊痘病毒入侵宿主细胞中发挥了重要作用，它的功能与山羊痘病毒的受体有关。