基于噬菌体展示技术的环形泰勒虫配基和蜱源受体的鉴定

Transmission of Piroplasm, the causative agent of Piroplasmosis, requires the completion of a complex life cycle in the tick, which includes invasion of the salivary glands and midguts. This invasion depends on the recognition of tick salivary gland and midgut surface components by the parasite. However, there is limited information on the invasion process and infection mechanism of Piroplasm in tick. By use of a phage display library, the work targeting Theileria annulata (T. annulata) ligands on Hyalomma anatolicum anatolicum (H. a. anatolicum), through 6 rounds of phage selection in vivo, and enriches the active ligands that specifically binds to the epithelia of tick, which binds to and competes for T. annulata receptor on the surface of the salivary glands and midguts. Binding Specificity of the ligands were verified by the method of Organ ELISA and Histochemical Staining, and it is further evaluated the roles that the ligands inhibit T. annulata Sporozoite invasion of salivary glands through the ligands were injected into the unfed female ticks. Furthermore, the identified T. annulata ligands as bait, By use of UV-crosslinking experiments between the peptide and its salivary gland and midgut target protein, to identify T. annulata receptors on the epithelia of the midgut and salivary glands of H. a. anatolicum. A better understanding of the mechanisms used by the parasite to develop in the H. a. anatolicum may lead to novel approaches to intervene with the spread of the disease.

梨形虫病是由梨形虫纲巴贝斯科或泰勒科原虫引起的蜱传性血液原虫病的总称，给畜牧业的发展造成极大的经济损失。但有关梨形虫对媒介蜱组织器官的侵入过程和感染机制的研究较少。本项目将噬菌体展示肽技术应用于环形泰勒虫配基的研究，从环形泰勒虫在小亚璃眼蜱体内发育成熟时期的蜱源细胞受体这一关键环节入手，通过多轮在小亚璃眼蜱体内的亲和筛选，富集与蜱源上皮细胞具有特异结合活性的配基，作为环形泰勒虫与表面受体结合的有效竞争物。应用器官ELISA、组织定位验证配基的靶向性，通过配基注射饥饿雌蜱的方法进行环形泰勒虫-蜱源受体阻断实验，以评估获得的配基活性分子抑制小亚璃眼蜱传播环形泰勒虫的作用。进一步，以鉴定的环形泰勒虫配基为钓饵，采用pull-down和质谱技术从小亚璃眼蜱唾液腺和中肠组织中获得和鉴定环形泰勒虫蜱源受体。最终为揭示环形泰勒虫入侵媒介蜱唾液腺和中肠的机理，靶向治疗和预防提供理论基础。

环形泰勒虫病是由环形泰勒虫引起的牛的一种蜱传性血液原虫病，主要传播媒介包括：残缘璃眼蜱和小亚璃眼蜱等。该病在全世界都有分布，危害严重，其发病率和病死率都很高，给养牛业造成重大经济损失。尽管环形泰勒虫的裂殖体细胞苗免疫防治效果较好，但对于媒介蜱传播环形泰勒虫这一环节的防控几乎没有作用。.本研究利用噬菌体随机肽库在残缘璃眼蜱体内筛选环形泰勒虫配基的方法初步筛选出了可能的环形泰勒虫配基，经生物信息学分析后，判断其可能是环形泰勒虫的表面蛋白Tasp和spm蛋白，将上述2个基因在原核表达载体PGEX-4T-1载体上进行表达，其中spm蛋白可与环形泰勒虫抗血清产生特异的反应条带。进一步验证原核表达纯化的Tasp和spm蛋白与残缘璃眼蜱中肠和唾液腺组织器官的结合能力，上述2个蛋白与中肠和唾液腺的结合能力都很弱。将抗Tasp抗体注射饥饿残缘璃眼蜱若蜱，之后进行环形泰勒虫传播实验，与抗GST抗体对照组相比，饥饿雌蜱唾液腺的染虫率只下降了约20%。因此，Tasp蛋白抗体注射阻断环形泰勒虫入侵唾液腺的作用并不明显。通过免疫共沉淀的方法也未能从残缘璃眼蜱中肠中筛选出Tasp蛋白的蜱源受体。在环形泰勒虫配基鉴定不顺利的情况下，分析了在不同媒介中对传播病原具有阻断作用的基因后，克隆了残缘璃眼蜱的subolesin基因和半胱氨酸蛋白酶基因，在原核表达载体PGEX-4T-1载体上分别表达并纯化蛋白，免疫印迹分析表明：上述2个蛋白具有较好的免疫反应特性。残缘璃眼蜱subolesin基因在不同组织都表达，但半胱氨酸蛋白酶基因只在中肠组织特异表达。RNAi和动物免疫保护实验结果表明：上述2个基因对残缘璃眼蜱的各项生理机能都具有重要作用。下一步，将采用抗体注射和RNAi技术探索环形泰勒虫Tasp和spm蛋白及残缘璃眼蜱subolesin和半胱氨酸蛋白酶基因在环形泰勒虫入侵残缘璃眼蜱唾液腺过程中的作用。此外，在开展媒介传播环形泰勒虫阻断实验时，为了排除试验用牛体及蜱感染其他梨形虫的可能性，在克隆了梨形虫RPS8基因及其发育遗传进化分析基础上，建立了牛梨形虫PCR-RFLP鉴别诊断方法。.该项目探索了环形泰勒虫病新的防治途径，将来可用环形泰勒虫不同发育阶段虫体特有抗原与传播媒介来源的蛋白组成鸡尾酒疫苗，在宿主动物感染和媒介传播环节上同时进行环形泰勒虫病的防治，此外，也可对传播媒介在种群数量上达到逐渐减少的目的