Massilia sp.对多环芳烃的降解作用及其生物组学研究

In this research, a high efficient polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-degrading bacterial strain, Massilia sp., isolated from PAHs-contaminated soil, will be used to investigate the biodegradation and its mechanisms involved in PAHs (phenanthrene, pyrene, and benzopyrene) biodegradation using high throughput sequencing, genomics and proteomics technologies. The objectives of this study are to study bioremediation of Massilia sp. in PAHs-contaminated soil, analyze changes in soil microbial community, assess the environmental effect of Massilia sp. in the bioremediation processes; sequence the whole genome of Massilia sp., verify sequence contigs, annotate gene function, complete the draft sequence of Massilia sp. genome, and predict the PAHs degradation genes; separate and identify the differential expression proteins induced by PAHs, uncover the key metabolic enzymes, and finally propose a complete PAHs biodegradation pathway for Massilia sp.. The results from this study will reveal the critical functions of Massilia sp. in PAHs biodegradation and offer a theoretical foundation for bioremedation of soil organic pollutants.

本项目拟运用高通量测序、基因组学、蛋白质组学等现代分子生物学的研究手段，揭示筛选获得的PAHs高效降解菌Massilia sp.对PAHs（菲、芘和苯并芘）的降解作用与机理。主要内容包括：分析Massilia sp.对PAHs污染土壤的修复作用，动态监测污染土壤中微生物群落的响应；完成Massilia sp.基因组测序、拼接、注释及草图/精细图的构建，探寻Massilia sp. 的PAHs降解功能基因；PAHs诱导Massilia sp.差异表达蛋白质的分离及鉴定，获取PAHs关键降解酶，结合基因组信息推断Massilia sp.对PAHs的代谢途径。研究成果将为深入认识PAHs生物降解机制和推进有机污染物的微生物修复技术发展提供理论及技术支撑。

从PAHs污染的土壤中分离到菲的高效降解菌Massilia spp. WF1、WG5、WX5等，WF1有较强的环境适应能力，在温度28 °C、pH 6、菲初始浓度100 mg L-1条件下菲的降解效果最好，48 h菲的降解率达96.78 %。不同碳源添加处理中菲的降解动力学均符合Gompertz方程，但外加碳源对菲的降解有不同的影响作用。WG5和WX5两株菌的16S rRNA基因序列完全一致，且两株菌生理生化上仅在LB液体培养条件下存在明显肉眼可见的区别，培养后期WG5菌株呈现浑浊而WX5菌株呈现絮状沉淀。完成这两株菌的全基因组测序后，分析发现两个菌株的全基因组相似度高达99.37%，主要区别在于WG5染色体基因组含有一个WX5基因组所没有的插入片段，而该插入片段上存在一个预测出来的MspWG5II甲基化修饰酶基因，并推测正是由于这个甲基化酶基因的存在改变了WG5菌株在LB液体培养基中的表型。由基因组降解功能基因分析推测出35个降解基因，并结合GC-MS、转录组RNA-Seq测序和分析结果推测出反式-2-羧基肉桂酸的代谢通路在WG5降解菲的代谢途径中起重要作用。WG5菌株对土壤中菲污染也有较好的修复能力，在添加WG5处理中土壤菲含量的下降非常快速。通过iHAAQ高通量绝对定量方法研究发现，添加WG5的处理中Massilia绝对含量随土壤菲含量降低而增加，热图和PCA分析表明WG5菌株是修复土壤菲污染高效且环境友好的生物修复材料。土培降解实验结果表明，多环芳烃降解菌WF1、Mycobacterium sp. WY10和黄孢原毛平革菌P. chrysosporium共培养体系对多环芳烃菲、芘污染土壤修复具有协同作用，细菌-真菌共培养体系将对于提高土壤中（尤其是水不饱和土壤孔隙中及贫瘠区域）污染物的修复有重要意义。另外研究发现，菌株WG5可通过葡萄糖合成途径合成聚羟基丁酸酯（PHB），合成的PHB聚合物样品纯度较高、均匀整齐、聚合度较好。与PE地膜相比，PHB膜可在三种类型土壤中快速降解。同时，开拓构建了两种土壤细菌群落结构高通量绝对定量方法，可同时获得物种的种类、绝对含量和相对丰度信息，为实现“宏观微生物生态”更完整、深入的研究提供新方法。