糖尿病相关蛋白质复合物 Kbtbd2/p85α/Cul3/Rbx1的结构与功能研究

In recent years, diabetes is on the rise across the world. It is necessary to study the mechanism of diabetes and insulin pathway to help with diabetes prevention and treatment. It has been found that Kbtbd2 is an essential regulator of insulin sensitivity. Mutations affecting this protein, Kbtbd2, cause severe insulin-resistant diabetes, lipodystrophy, hepatic steatosis, and growth retardation. Kbtbd2 is the substrate recognition subunit of a Cullin3(Cul3）based E3 ubiquitin ligase, and its essential molecular target is p85α, the regulatory subunit of phosphoinositol-3-kinase. In the absence of Kbtbd2, p85α levels rise 30-fold in adipocytes, interrupting the insulin signal. Within adipocytes, Kbtbd2 expression is markedly down-regulated in response to a high-fat diet. This appears to be an important cause of the insulin resistance caused by obesity. It has been hypothesized that Kbtbd2 may regulate systemic insulin sensitivity by controlling the cytoplasmic concentration of p85α in adipose and other tissues in humans as in mice. .This proposal aims to determine the structures of Kbtbd2 and Kbtbd2/P85α/Cul3/Rbx1 complex by single particle cryo-electron microscopy. The proposed research will not only provide the structure information Kbtbd2, but will also clarify the follow questions: 1) How does Kbtbd2 interact with Cul3? 2) How does Kbtbd2/Cul3 complex interacts with p85α and regulate its level in the cells? The structure information will help us understand Kbtbd2 functional mechanism and eventually provides theoretical basis for the diagnosis and treatment of insulin resistance and diabetes.

近年来，全球2型糖尿病的发病人数显著增加，糖尿病机理及防治研究愈加迫切。Kbtbd2是一种新识别的胰岛素信号通路的必要调节因子。该蛋白缺陷可导致小鼠发生严重的胰岛素抵抗，糖尿病，脂肪代谢障碍及脂肪肝。研究结果显示：Kbtbd2与Cullin 3（Cul3）/Rbx1形成复合物，识别并调控其底物p85α的水平，影响着胰岛素信号传导通路。.为了深入了解Kbtbd2及其复合物的结构与功能，本项目拟主要利用单颗粒冷冻电镜法，综合其他生物物理和生物化学方法，阐明各组分的结构及相互作用方式，识别参与蛋白质相互作用及其参与信号传导的机制。目前该项目已经获得了高纯度的Kbtbd2，组装了复合物，为后续的研究提供了坚实的基础。本项目研究不仅有助于了解该复合物参与调节胰岛素信号通路的机制，也为胰岛素抵抗及糖尿病诊治的研究提供基础。

人体中约80%的蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）进行降解，Cullin-RING E3泛素连接酶（Cullin-RING E3 ligases, CRLs）作为哺乳细胞中最大的E3泛素连接酶家族，在底物的特异性选择及泛素化修饰方面发挥重要作用。p85α是PI3Kα的调节亚基，其过量积累会造成胰岛素代谢异常，最终导致胰岛素抵抗和 Ⅱ 型糖尿病。KBTBD2是近年来新发现的p85α调控蛋白，可与Cullin3及Rbx1组成Cullin3-Rbx1-KBTBD2（CRL3KBTBD2）复合体，催化底物p85α的泛素化修饰，使其被26S蛋白酶体降解，达到调控胰岛素代谢的效果。由于CRL3的底物受体亚基在结构上以二聚体的形式存在，使得CRL3复合体的组装非常复杂，同时过于动态的催化过程给CRL3复合体的结构解析带来巨大的困难，因此到目前为止，CRL3的结构及催化机制尚不清楚。.为了系统阐述CRL3在其催化循环过程中的动态结构变化和工作机制，本课题解析了CRL3KBTBD2在自组装及底物招募（CRL3KBTBD2-p85α）状态下复合体的冷冻电镜结构。生化实验与结构分析表明：CRL3KBTBD2以二聚体为基本结构单位，通过Cullin3 CTD-CTD互作组装成独特的四/六/八聚体结构，即为了维持结构的稳定，单独的CRL3KBTBD2多以高聚体形式存在，当与p85α结合后会解聚为二聚体，这与目前已解析的其他CRLs单体结构有所不同。CRL3KBTBD2招募底物 p85α时，KBTBD2的BTB-BACK与Kelch两个结构域协同发挥作用，其中BACK的α13-α14螺旋对向Kelch方向发生约160°的翻转，为底物的招募提供最大的结合力。.P85α不仅与糖尿病相关，也参与很多重要疾病的调控，本研究为糖尿病及其他相关疾病防治提供了新的靶点及思路。此外，Cullin3可利用180多种BTB蛋白调节各种生理过程，本研究为理解其他CRL3复合物的作用机制提供了基础，并有助于理解Cullin家族其他成员的工作机制。..我们也对新冠关键蛋白与小分子抑制剂及抗体的复合物结构进行了研究，为药物开发提供指导。