李斯特菌对IIa类细菌素诱导性抵抗的产生和机制研究

Listeria monocytogenes is an important genus of food-borne pathogens which can transmit into human body through food contamination and cause food safety issue. It is necessary to adopt efficient and feasible control to decrease the risk of Listeria infection. Class IIa bacteriocins produced by lactic acid bacteria show strong inhibition activities against food-borne L. monocytogenes, which have prospect of application in food industry as biopreservatives. This project aims at the wild type L. monocytogenes strains, which are planned to obtain induced resistance to class IIa bacteriocin under laboratory conditions, for exploring the reasons and characteristics of developing bacteriocin resistance. Firstly, the resistant level, frequency, and stability are studied. The influence of environmental factors on the resistant characteristics of mutant strains are analysed. Then the different patterns of growth and metabolism between wild type and resistant strains are evaluated at the levels of gene expression and regulation, targeting to the crucial genes and related metabolism regulation routes. The mannose phosphotransferase system and other possible bacteriocin-resistant mechanisms are evaluated for better understanding the mode of action of class IIa bacteriocins. The results may provide theoretical reference for application of class IIa bacteriocins in biopreservation of food-borne pathogens.

单增李斯特菌是重要的食源性致病菌，可通过污染的食品进入人体，引发食品安全事件。为了降低李斯特菌感染的风险，必须采取高效可行的方法进行防治。乳酸菌产生的IIa类细菌素对食源性单增李斯特菌具有明显的抑制作用，有望作为生物防腐剂应用于食品工业。本项目以野生型单增李斯特菌为研究对象，通过在实验室条件下诱导获得IIa类细菌素抗性菌，探讨细菌素抗性的产生原因和特点。首先，将筛选获得的细菌素抗性突变菌株的抗性强度水平、频率、稳定性进行研究，分析环境因素对突变菌株抗性特点的影响作用。继而着重从基因表达和调控水平对比野生型菌株和抗性菌株之间的生长代谢差异。对甘露糖磷酸转移酶系统及可能存在的其他细菌素抗性产生机制进行分析，加深对IIa类细菌素作用方式的认识。为IIa类细菌素在食源性致病菌生物防腐领域的应用提供理论依据。

近年来，由抗生素抗性菌导致的人畜疾病急剧增加，化学合成防腐剂的毒性问题也倍受关注。作为天然防腐剂的IIa类细菌素，与抗生素和传统防腐剂发挥活性的原理有着本质的不同，被认为在食品防腐和医疗卫生方面具有良好的应用前景。本研究诱导获得对IIa类细菌素产生抗性的单增李斯特菌、伊氏李斯特菌和无害李斯特菌菌株并与原始菌株对比分析特点及抗性产生机制。采用片球菌素诱导获得的单增李斯特菌抗性菌株同时对另外两种IIa类细菌素植物乳杆菌素和弯曲乳杆菌素的敏感性下降，但与原始菌株相比，对nisin与氨苄青霉素的敏感性无差异。碳水化合物的代谢与细菌素敏感性关系密切。原始菌株在添加葡萄糖或甘露糖的培养基中生长情况优于抗性菌株，而在纤维二糖中生长情况不如抗性菌株。抗性菌株的细胞表面疏水性显著提高，细胞表面对片球菌素的吸附量下降，且抗性不是来源于菌株胞外活性物质（蛋白酶）的分泌。抗性菌株的mptA基因表达水平存在差异，因此man-PTS不是细菌素产生抗性的唯一机制。与原始菌株相比，片球菌素诱导获得的伊氏李斯特菌抗性菌株对另外两种IIa类细菌素的敏感性均下降，但对氨苄青霉素和卡那霉素的敏感性不变。抗性菌株细胞表面疏水性显著提高且易形成聚合物，对片球菌素的吸附量减少，但不分泌使细菌素失活的代谢产物。植物乳杆菌素诱导获得的无害李斯特菌抗性菌株对另外两种IIa类细菌素的敏感性也均出现下降，细胞表面疏水性显著提高，菌体细胞饱和脂肪酸含量提高。综合分析，抗性机制来源于菌株对碳源的代谢途径、细胞表面特性（例如疏水性和聚集性）以及功能基因表达水平等多种因素调节，也说明菌株能够利用不同机制的应激响应获得抗性来达到适应环境的目的。