安丝菌素产生菌珍贵束丝放线菌的自身抗性机制

Ansamitocin, produced by Actinosynnema pretiosum, exhibits potent antitumor activity. However, the commercial application of ansamitocin is limited by its low productivity. In previous studies, we found that the cytotoxicity of ansamitocin to its producer was the main reason for low yield, therefore improving the resistance of Actinosynnema pretiosum will be an effective strategy to enhance ansamitocin production. However, the cytotoxic mechanism and the resistance mechanism of ansamitocin has not been elucidated yet. In this study, the corresponding mechanism will be investigated, and it will be helpful for the yield improvement and commercial application of ansamitocin. In this study, on one hand, the intracellular binding target of ansamitocin will be isolated and identified using small-molecule probe and proteomics technology, the cytotoxicity mechanism of ansamitocin will then be illuminated. On the other hand, the comparative transcriptomic data of Actinosynnema pretiosum cultivated under different concentration of ansamitocin was detected, and the self-resistance mechanism of Actinosynnema pretiosum will be clarified based on comprehensive screening of resistance genes by comparative transcriptome analysis and mutagenesis based resistant gene identification. Finally, by modification of the target gene and resistant genes, the toxicity of ansamitocin to Actinosynnema pretiosum will be reduced, and the resistant level, as well as ansamitocin yield, will be improved.

由珍贵束丝放线菌产生的安丝菌素具有极强的抗肿瘤活性，但较低的发酵产量严重限制了其产业化发展。前期研究表明，安丝菌素对其产生菌的毒性是限制产量提高的主要原因之一，而增强菌株抗性将会有效促进产量提高。然而，安丝菌素对产生菌的毒性机理及产生菌相应的抗性机制尚未被阐明。本项目旨在解析对应机理，并为安丝菌素的高产及产业化应用打下基础。我们将一方面通过小分子探针及蛋白质组学技术钓取安丝菌素的胞内毒性靶标蛋白，在此基础上解析安丝菌素对产生菌的毒性机理；另一方面，以不同安丝菌素浓度下菌株的差异转录组信息为主，随机诱变-抗性检测-基因组重测序的方式为辅，全面筛选安丝菌素的抗性基因，并探究抗性与安丝菌素生物合成的关系，阐明安丝菌素产生菌的抗性机制。在上述基础上，定向改造安丝菌素毒性靶标基因，降低安丝菌素对产生菌的毒性；同时，优化抗性基因的表达，全面提升产生菌的抗性水平，最终实现安丝菌素的高产。

安丝菌素 P-3（ Ansamitocin P-3， AP-3）可与真核细胞的微管蛋白结合，抑制微管组装，因此具有强抗肿瘤活性。 在本研究中，我们发现 300 mg/L 以上的安丝菌素对其产生菌的生长产生强烈抑制， 判断此为限制产量提高的重要因素。 针对这一问题，本研究从毒性和抗性两方面入手，探讨其解决方式。首先， 本研究对 AP-3 的毒性机理进行了探究。 通过蛋白结构比对及体外分子相互作用分析， 确定 AP-3 在原核细胞内的毒性靶标蛋白为其在真核细胞中毒性靶标 β-微管蛋白的结构类似物 FtsZ。 通过分子对接模拟， 发现 AP-3 通过氢键与疏水作用力稳定结合于 FtsZ 蛋白表面 GDP 口袋附近的低亲水区。 过量表达 FtsZ 蛋白的编码基因APASM_5855 后，所得菌株的 AP-3 抗性大幅提高，AP-3 产量由 250.66 mg/L 最终提升至 371.16 mg/L。其次， 通过提高 AP-3 的外排效率， 本研究成功提升了菌株的 AP-3 抗性及产量。通过比较转录组结合基因敲除实验， 我们成功筛选到5 个可能参与 AP-3 外排的基因 APASM_2704、 APASM_3193、APASM_6861、 APASM_4431 和APASM_2805。 过量表达与 AP-3 相关的 转 运 蛋 白 基 因 APASM_2704 、 APASM_3193 、 APASM_6861 、APASM_4431 和 APASM_2805 将 AP-3 的产量从 264.6 mg/L 分别提升至 302.4、320.4、330.6、304.0 和 320.6 mg/L。综上所述，通过过量表达 FtsZ 编码基因和提高外排效率两方面， 本研究均有效提升了 AP-3 的产量， 为抗生素产生菌抗性及产量提高的相关改造提供了借鉴和指导。