CCR6/Mip-3α轴在动脉粥样硬化发病中的作用及机制研究

Atherosclerosis (AS) is the major pathological basis for a variety of cardiovascular diseases. In agreement with others, we have found that CCR6/Mip-3α axis plays a critical role in the development of chronic inflammatory disorders, and the axis is involved in a variety of pathophysiological mechanisms of chronic inflammation through regulating CCR6+ T- cell migration and releasing IL-17 and other inflammatory factors. AS is a chronic inflammatory disease in which the role CCR6/Mip-3α axis remains unclear. Our preliminary data showed that not only CCR6+ T-cells but also macrophage expressing Mip-3α infiltrated the arterial wall of AS patients. Thus, we propose the following hypothesis: the CCR6/Mip-3α axis may be involved in the pathogenesis of AS, and block the CCR6/Mip-3α axis possibly inhibits its development. To this end, we will use the apoE-/- mouse model and the CCR6-/-apoE-/- double knockout mouse model (already established in our group) to investigate the role of CCR6/Mip-3α axis in the AS pathogenesis and its molecular mechanism. The confirmation of the CCR6/Mip-3α axis hypothesis in AS may improve our understanding in the pathomechanisms and help to develop potential drug therapeutic targets.

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是多种心脑血管疾病的主要病理基础。申请者和他人的研究均已证明，CCR6/Mip-3α轴通过调控CCR6+ 细胞炎症部位的迁移及释放IL-17等炎症因子，参与多种慢性炎症性疾病的病理生理机制。AS也是一种慢性炎症性病变，但CCR6/Mip-3α轴是否参与AS发病未见报道。我们的预初研究发现：在AS患者的动脉壁存在大量CCR6+ T 细胞以及表达Mip-3α的巨噬细胞聚集。由此我们提出如下假设：CCR6/Mip-3α轴可能参与AS发病机制，阻断该轴对AS的形成将起抑制作用。为此，我们采用已经构建成的CCR6-/-apoE-/- 双基因缺陷和apoE-/- 小鼠模型，探索CCR6/Mip-3α轴在AS发病中的作用及分子机制。本课题"CCR6/Mip-3α轴"的AS发病假说如被证实，将为AS发病的炎症学说提出又一新的分子机制和潜在药物治疗靶点。

背景：近来的研究表明， the chemokine/receptor system CCL20/CCR6 在动脉粥样硬化的病程中起着很重要的作用，但其具体的调控机制少有报道。本研究拟探索CCR6/CCL20轴在动脉粥样硬化发病中的具体分子机制。..方法：本研究采用已经构建成的CCR6-/-apoE-/- 双基因缺陷和apoE-/- 小鼠模型， 高脂喂养诱导动脉粥样硬化小鼠模型组和干预组；小鼠显微超声(UBM)和H.E染色法分别检测斑块面积的变化；免疫组化和RT-PCR检测各组小鼠血管组织中CCR6 和CCL20的表达；筛选了760 个miRNAs 在各组小鼠血管中表达；电脑软件分析差异表达的miRNA 可能靶向基因；用Dual Luciferase Reporter assay system确认靶向；细胞转染； 内皮细胞成血管实验。..结果：目前研究结果表明， 在CCR6-/-apoE-/- 双基因缺陷小鼠中，硬化斑块面积，CCR6 和CCL20的表达及巨噬细胞的聚集均显著小于apoE-/- 小鼠； 在760 个miRNAs中筛选到约10个2 –ΔΔCT (> 3.0-fold)的miRNAs，RT-PCR再次验证了表达差异最大的miRNA-27b ；系列电脑软件分析了miRNA-27b可能靶向基因，发现了与血管新生密切相关的基因Tbdn-1；用Dual Luciferase Reporter assay system 在NIH3T3 cell lines中确认了miRNA-27b和Tbdn-1其间的靶向；同时免疫组化和RT-PCR检测到Tbdn-1在CCR6-/-apoE-/ 组小鼠的血管中表达显著高于apoE-/- 小鼠。免疫荧光染色结果表明在小鼠CD31的表达在CCR6-/-apoE-/ 组小鼠的血管斑块中显著低于apoE-/- 小鼠；转染了siRNA Tbdn-1 or siRNA NC 和 miRNA27b- mimic or miRNA-NC 到小鼠血管主动脉内皮细胞，成血管发生均显著高于对照组。 ..结论：CCR6基因敲除有效改善动脉粥样硬化病程， 有可能是通过炎症或通过调节差异表达的miRNA-27b及其靶基因Tbdn-1， 而最终调控斑块病变进程（面积及斑块的稳定性）。