复发性流产特征性甲基化谱的建立及机制研究

Recurrent spontaneous abortion(RSA) is one of the most common disorders in women of reproductive age. Its prevalence is estimated at between 1% and 3% in the general population. DNA methylation is an important aspect of epigenetics and gene regulation. DNA methyaltion factor has been reported to be associated with various kinds of diseases. Up till now, there is little study on epigenetic methylation of RSA. We found the methylation lever of MEST gene was associated with RSA before.In the study, by using highthroughput sequencing technology, we first demonstrate the whole-genome DNA methylation differentiated profile based on pheripheral blood and placental villus samples. Then, differentiated gene expression profile is built by microarray. By bioinformatics on combining the data of DNA methylation profile and gene expression profile, candidate genes associated with RSA are founded.We then validate genes in a large sample size by using Massarray quantitative methylation analysis. We study the function of genes in Villous Trophoblasts. We believe that we can systematically demonstrate the important role of epigenetic methylation factor in RSA and findings could promote the study of mechanism of the disease and the development of the treatment.

复发性流产（RSA）在育龄女性中的发病率约1%-3%，并呈逐年递增趋势，而其发病机制尚不清楚。研究发现，许多DNA甲基化位点与疾病的发生发展相关，但关于特定基因的甲基化与RSA的关系还鲜有报道。我们在前期研究中观察到MEST基因的甲基化水平与RSA相关，提示DNA甲基化可能在RSA病理过程中发挥重要作用。还有哪些基因的甲基化与RSA相关，其分子调控途径如何，是本课题所要解决的重要科学问题。本课题拟建立RSA的病例-对照队列，收集外周血及胎盘绒毛组织样本，应用新一代全基因组测序技术，建立RSA全基因组甲基化和转录组差异谱；通过生物信息学方法，筛选出转录变化与甲基化变化相对应的候选基因，并利用定量甲基化分析技术在大样本中对候选基因的甲基化位点进行验证；最后，以人绒毛膜细胞为模型，研究分析MEST等候选基因的甲基化异常导致滋养层细胞功能异常的分子机制，揭示DNA甲基化异常在RSA病理中的作用。

复发性流产（RSA）在育龄女性中的发病率约1%-3%，呈逐年递增趋势，其发病机制尚不清楚。研究发现，许多DNA甲基化位点与疾病的发生发展相关，但关于特定基因的甲基化与RSA的关系还鲜有报道。我们在前期研究中观察到MEST基因的甲基化水平与RSA相关，提示DNA甲基化可能在RSA病理过程中发挥重要作用。还有哪些基因的甲基化与RSA相关，其分子调控途径如何，是本课题所要解决的重要科学问题。. 本课题完成了RSA病例-对照队列的建立及相关组织样本的收集，运用illumina Hiseq2500平台进行了全基因甲基化组和转录组测序，建立了RSA全基因组甲基化和转录组差异谱。通过甲基化和表达联合分析得到与RSA显著相关的差异基因。通过焦磷酸测序及qPCR方法对甲基化和表达差异位点进行了验证。本研究还对外周血基因组中炎症免疫等相关基因SNP与RSA疾病之间关系进行了关联研究，并分析了特定候选基因甲基化水平的变化对人滋养层细胞生理特性的影响及其作用途径。. 在全血、绒毛及蜕膜组织中分别鉴定得到11515，12019及6030个差异甲基化位点；在绒毛及蜕膜组织中鉴定了2631及928个差异表达基因。筛选出绒毛及蜕膜组织差异基因进行大样本表达及DNA甲基化验证。结果显示NPFFR2和IGF2BR1在RSA患者中绒毛组织和蜕膜组织中显著上调，而MTRR和FLT1则相反。在RSA患者蜕膜组织中IGF2BP1启动子区存在显著低甲基化。两组织联合分析，得到55个RSA显著相关差异甲基化及表达基因，其中11个基因与妊娠相关。构建蛋白互作网络发现SPP1是核心蛋白且ITGA5是其互作蛋白。对这两个基因进行表达和甲基化验证显示ITGA5和SPP1在RSA患者绒毛和蜕膜中均高表达，且ITGA5启动子区有4个差异甲基化CpG位点（P=0.019）。发现外周血基因组炎症免疫相关基因FAU（MNSF-β）及前动力蛋白受体（PKR）等相关基因多态性与RSA相关，同时对与RSA相关的基因部分基因进行了功能研究。鉴定得出的显著基因，显著通路和蛋白作用网络均为RSA机理研究及防治方案提供研究切入点，探究RSA疾病机制，有利于防治和降低孕产期 RSA的风险，提高我国孕产妇健康水平。