CD14与LPS/LBP复合物结合位点的定位及抗内毒素小分子药物的筛选

LBP/CD14, which is called endotoxin sensitivity enhancing system,is located at the upstream of the LPS-induced inflammatory signal pathway. LPS induced inflammatory signal pathway is started by the binding of CD14 and LPS/LBP complex. However, the accurate understanding of combination mode between CD14 and LPS/LBP is absence. Although the previous studies indicate that CD14 has both LPS binding domain and LBP binding domain, it is an innegligible fact that CD14 combine with LPS/LBP complex, rather than combine with LPS or LBP separatly. Thus, we speculate that CD14 has an independent functional domain that can combine with LPS/LBP complex. So, antagonism against the endotoxin sensitivity enhancing system, LPS/LBP/CD14, can efficiently inhibit the proinflammatory role of LPS. We plan to orientate the binding domain between the CD14 and LPS/LBP complex by T7 phage display and gene mutation,using LPS/LBP complex as substrates.And then, we are going to reveal the three-dimensional structure of this binding domain by biological information technology for screening some anti-endotoxin small molecule drugs, in order to offer a more ideal prevention and therapy strategy for endotoxin-induce acute respiratory distress syndrome.

LBP/CD14位于脂多糖（LPS）致炎信号通路的上游，且对LPS具有增敏作用。LPS需与LBP形成复合物才能与CD14结合，从而启动LPS致炎信号通路。然而,目前对LPS/LBP复合物与CD14的结合方式尚缺乏准确的认识。虽然既往的研究表明CD14兼具与LPS和LBP结合的功能域,但CD14实际上是与LPS/LBP复合物相结合，而不是分别与LPS或LBP中的任何一者单独结合。因此，我们推测CD14应该具有独立的与LPS/LBP复合物结合的功能域。为此,本研究拟以LPS/LBP复合物为筛选底物,利用T7噬菌体展示技术、基因突变技术定位CD14与LPS/LBP复合物结合的功能域,并利用生物信息技术构建该功能域的三维结构,筛选具有能特异性封闭该功能域的小分子药物,并通过体外及动物试验验证其抗内毒素活性。以期获得更理想的防治内毒素性急性呼吸窘迫综合征的方法。

一、项目的背景.LBP/CD14位于脂多糖（LPS）致炎信号通路的上游。拮抗LBP/CD14无疑是防治内毒素性急性呼吸窘迫综合征的理想策略。LPS或LBP通过形成LPS/LBP复合物后与CD14结合，LPS与LBP形成复合物后必然会改变两者的空间构型及其活性表位。因此，我们推测CD14与LPS/LBP复合物的结合功能域可能与既往研究所发现的LPS/CD14或LBP/CD14结合位点截然不同，而且该结合功能域才是LPS启动其炎症信号通路的关键。因此，精确定位CD14与LPS/LBP复合物的结合功能域，并针对该功能域筛选出高效的抗内毒素小分子药物，有望增进理解CD14的结构与内毒素致炎作用间的关系，为防治内毒素性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）提供较理想的策略。.二、主要研究内容.① 采用温孵法构建LPS/LBP复合。.② 采用生物信息技术，初步筛选CD14与LPS/LBP复合物结合的功能区域。.③以该结合功能区域为标靶，筛选能与该区域特异结合的小分子药物。.④以LPS/LBP复合物作为底物，通过亲和实验和竞争抑制实验筛选体外能特异性阻断LPS/LBP复合物与LPS结合的小分子化合物。.⑤通体外细胞实验及内毒素大鼠模型体内实验，观测筛选所得小分子化合物抗内毒素诱导炎症的效。.三、重要结果及关键数据.1. 成功构建LPS／LBP复合物。.2. CD14_human的结构分析提示N端表的疏水“口袋”，可能成为小分子化合物结合的靶点。.3.选择ZINC和ChemDiv作为筛选化合物的首选库, 经过两级筛选和对接，获得结合能最高6个小化合物。.4. 竞争、抑制实验筛选出四个小分子化合物选择抑制率>40%。以上为候选抗CD14小分子化合物。.5. 候选抗CD14小分子化合物能抑制LPS诱导的NF-κB结合活性和TNF-a的转录和表达。.6. ZINC32983984能提高内毒素性急性呼吸窘迫综合征大鼠的动脉动血氧水平，降低ARDS发生率和死亡率。.四、科学意义.本研究发现CD14 N端表面的疏水“口袋”可能为LBP/LPS复合物接合的功能域，根据该功能域空间结构筛选的小分子化合物在体内体外均表现出较强的抗内毒素作用，能降低ARDS的发生率和死亡率。可能为深入研究CD14的功能及及临床内毒素ARDS的防治提供理论基础。