近红外I/II双色荧光显微成像研究结肠癌演进中肿瘤细胞与免疫微环境的相互作用

In response to the second research subject of the RFP of the principle project, this proposal will aim to visualize the composition and characterization of the immune microenvironment during colon cancer development. A near infrared window II (NIR II, 1000-1700 nm) fluorescence molecule BPBBT has been screened, whose nano-preparation exhibits aggregation-induced emission effect. Based on the design of BPBBT nanoparticles for the NIR II probe and indocyanine green derivatives for the NIR I (830-880 nm) probes, and the establishment of NIR I and II dual-color fluorescence intravital microscope, we will dynamically visualize the interaction between tumor cells and blood vessels, T cells, macrophages, or neutrophils during the colon cancer development; and the roles of the immune checkpoint blockade molecules CD47 in tumor cell recognition and phagocytosis by macrophages, as well as the roles of programmed cell death protein 1 (PD-1) and its ligand (PD-L1) in tumor cell killing by CD8+ T cells, in order to elucidate the mechanism how these molecules affect tumor development. The novelty of this study is to build NIR dual-color microscopy based on NIR II probe with aggregation-induced emission property, for visualization of the development of tumor immune microenvironment and the function of the key molecules.

针对方向二“肿瘤免疫和代谢微环境演进的可视化”，本课题以结肠癌演进中免疫微环境构成与特征的可视化分析为研究目标，筛选得到近红外II区（NIR II，1000-1700 nm）荧光分子BPBBT，并制备纳米复合物，在水中产生聚集诱导发光效应。设计以BPBBT 纳米为NIR II探针，以吲哚菁绿为母核结构的NIR I（830-880 nm）探针，构建NIR I和II双通道荧光活体显微成像系统，动态观察结肠癌演进过程中肿瘤细胞与血管、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞相互作用；可视化研究肿瘤微环境中免疫检查点分子CD47在巨噬细胞识别、吞噬肿瘤细胞，程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）及其配体（PD-L1）在CD8+ T细胞杀伤肿瘤细胞中的作用，旨在揭示其影响肿瘤发生发展的机理。本项目创新点是基于聚集诱导发光NIR II探针创建近红外双色荧光显微成像方法，可视化解析肿瘤免疫微环境的演进及关键分子的功能。

针对重大研究计划方向二“肿瘤免疫和代谢微环境演进的可视化”，本项目以结肠癌演进中免疫微环境构成与特征的可视化分析为研究目标，筛选得到近红外II区（NIR II，1000-1300 nm）荧光分子BPBBT，并制备纳米复合物，在水中产生聚集诱导发光效应。设计以BPBBT 纳米为NIR II探针，以吲哚菁绿等为NIR I（650-880 nm）荧光探针，构建NIR I和II双通道荧光活体显微成像系统。此外，制备了一种NIR IIb（1500-1700 nm）荧光量子点CSQD，实现在NIR IIb通道对血管进行成像。建立了适用于结肠癌演进实验研究的小鼠模型，于小鼠盲肠部位注射CT26-Luc结肠癌细胞悬液，种瘤后14天和21天分别发现淋巴结转移与肝转移。动态观察结肠癌演进过程中肿瘤细胞与血管之间的动态关系，发现肿瘤细胞无显著运动，未发现肿瘤细胞有向血管移动的趋势。随着肿瘤的发生发展，CD8+ T细胞在肿瘤周边区域浸润显著增加，CD8+ T细胞与肿瘤细胞相互接触，但肿瘤中心区域的CD8+ T细胞浸润程度较低。与第7天相比，种瘤后第14天的小鼠肿瘤中CD8+ T细胞距离血管更远。动态观察发现肿瘤组织中肿瘤细胞高表达程序性细胞死亡受体-配体1（PD-L1）表达，提示PD-L1可能是肿瘤演进过程中关键分子。本项目通过建立的NIR I/II 双通道并继而发展了NIR I/II/IIb三通道荧光活体显微成像的新型分子影像可视化方法，实现了对结肠癌模型肿瘤免疫微环境的可视化。本项目设计的一系列NIR II、IIb荧光分子探针、影像手段，以及动态研究结肠癌免疫微环境中细胞间互作方式以及关键分子的方法，为重大研究计划提供从分子与细胞动态互作角度进行可视化研究的技术支撑。