基于印迹交联酶聚体技术酶活性构象的“复制”及其催化活性研究

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是治疗苯丙酮尿症和合成L-苯丙氨酸的关键酶,但在应用中，其活力低、不稳定，成为限制其使用的主要瓶颈。研究表明，导致酶失活的主要原因是构象发生了变化。因此，如果能将酶活性构象永久的"复制"下来，使其保持一定的"分子记忆"效应，无疑对改善酶活性和稳定性有重要意义。课题组以PAL为模型酶，将印迹酶制备方法与交联酶聚体技术相结合设计一种新的快速交联固化体系, 以实现对酶活性构象的完整"复制"，建立新型生物催化剂-"复制酶"的制备方法。考察"复制酶"在不同相态下的催化活性；通过对"复制酶"微观结构、"复制"前后和"复制"过程中构象变化特点和催化活性的相关性研究，揭示"复制酶"微观结构与催化活性间的相关关系及其构象变化规律，为从根本上解决PAL活力低、不稳定的问题奠定基础，为此"复制"技术应用于其它酶种积累共性规律与经验，也为进一步阐明酶分子结构与催化功能的构效关系提供新思路。

酶是高效的生物催化剂，但在实际应用过程中，很多酶表现出不稳定、易失活，极大的限制了酶的广泛应用。研究表明，导致酶失活的主要原因是活性构象发生了变化。本项目以苯丙氨酸解氨酶（PAL）为模型酶，利用印迹交联酶聚体技术将酶的活性构象的“复制”并“固定”下来，显著的提高了PAL的催化活性和稳定性。其主要内容包括：产PAL粘红酵母的高密度培养及PAL的提取；PAL活性构象的“复制”及“复制酶”制备条件优化；“复制酶”催化性能及稳定性研究；不同制备方法对“复制酶”催化活性和稳定性的影响；“复制酶”微观结构及其与催化性能间的关系研究。结果表明，在优化的制备条件下，与游离酶相比，利用印迹交联酶聚体技术所制备的“复制酶”具有较高的催化活性，特别是其热稳定性、操作稳定性、重复使用性和有机溶液耐受性等都有显著的提高。此外，在制备过程中添加淀粉和牛血清白蛋白能显著改善“复制酶”的催化性能。同时发现，将“复制酶”固定在大孔硅胶上能显著提高其重复使用效果。为从根本上解决PAL活力低、不稳定的问题提供理论基础，并为此"复制"技术应用于其它酶种积累了共性规律与经验。 本项目在国内外发表论文11篇，其中被SCI收录论文8篇，总SCI影响因子达到24.3，SCI一区论文3篇。