微泡介导CRISPR/Cas9靶向FLT3-ITD突变:基因突变靶向新策略?

Gene mutational status is a key prognostic factor for acute myeloid leukemia (AML). In the era of molecular therapy, exploring innovative means to target gene mutations is still of great value. Genome editing technology, represented by CRISPR/Cas9, has shown huge potential in gene therapy of various disease models, but the lack of a suitable vector limited its broader application. The applicant’s previous studies confirmed that，targeted disruption of the FLT3 gene by genome editing tool TALENs conveys sustained proliferative inhibition in leukemia cells. The bottleneck of systemic in vivo delivery of genome editing tools is to find a low toxicity, highly efficient and high-throughput vector. In this study, we innovatively exploit the usefulness of a biologic carrier named microvesicle (MV). By loading the MVs from mesenchymal stem cells (MSC) with CRISPR/Cas9 RNA in different ways and observing the in vitro and in vivo biologic effects of CRISPR-loaded MSC-MVs to leukemia cells with internal tandem duplication (FLT3-ITD), we plan to target the FLT3-ITD mutation which has a prognostic significance in AML and to preliminarily investigate the mechanisms that modulates the loading process of CRISPR/Cas9 RNA by MVs. This study is the first to combine CRISPR/Cas9 technology and MV as a biologic vector, and may breakthrough the limitation of clinical transformation for CRISPR technology. It may also expand the theory and application of MVs as a therapeutic delivery method. Furthermore, this study might provide a novel targeting strategy to many sequence-specific mutations in AML.

基因突变是决定急性髓系白血病（AML）预后的重要因素。分子治疗时代，探索新的基因突变靶向手段具有重要价值。以CRISPR为代表的基因组编辑技术在基因治疗中已显示了巨大潜力，但缺乏合适的载体限制其更为广阔的应用。我们前期利用基因组编辑技术TALENs定点破坏FLT3基因引起白血病细胞持久的增殖抑制。而低毒、高效、高通量的载体是基因组编辑工具系统性在体投递的关键瓶颈。本课题创新性的以生物载体微泡（MV）为切入点，拟通过不同方式装载CRISPR RNA至间充质干细胞MV，靶向AML中具有预后决定意义的FLT3-ITD突变，离体和在体观察生物学效应并初步探讨调控MV装载CRISPR RNA的机制。本研究首次将CRISPR技术与高通量生物载体MV相结合，有望突破该技术临床转化的载体瓶颈，拓展MV作为治疗性投递工具的理论和应用价值，并对AML中序列特异性的关键基因突变提供新的靶向策略。

CRISPR/Cas9系统是一种高效基因编辑系统，成功应用于基因治疗领域，但该系统的临床应用一直受到递送方法和安全性的限制。胞外囊泡（EVs）可以由几乎所有类型的细胞释放，并作为在细胞之间传递分子的穿梭物。为了使CRISPR/Cas9系统能够实际而有效地应用到临床上，我们将EVs作为CRISPR/Cas9系统的传递平台，并使用嵌合抗原受体（CAR）修饰EVs，并观察该传递平台在体内外的安全性和抗肿瘤作用。我们通过流式细胞学，细胞活力和增殖实验，评估了CAR修饰后EVs或未修饰EVs在体外的细胞摄取效率和安全性。通过Sanger测序选择靶向MYC基因的最佳sgRNA，并通过电穿孔的方式将靶向MYC的sgRNA/Cas9质粒装载到EVs中。然后将CD19阳性细胞与装载靶向MYC的sgRNA/Cas9的修饰后EVs或未修饰EVs共孵育，通过细胞活力，增殖和凋亡实验，以及Sanger测序，评估修饰后EVs或未修饰EVs对MYC靶向CRISPR/Cas9的体外递送效果。并进一步通过小鼠实验，观察两种EVs在体内的生物分布和靶向抗肿瘤功效。我们发现，CAR修饰后EVs与正常EVs相比，对CD19阳性细胞表现出更强的趋向性，且CD19阳性细胞的摄取随时间增加。而这两种EVs在所测试的浓度和孵育时间下，均对CD19阳性细胞的增殖扩增没有影响。通过电穿孔的方式将靶向MYC的sgRNA/Cas9质粒装载到EVs中，并与CD19阳性细胞共孵育后，我们发现CD19阳性细胞增殖被抑制，且凋亡增加，表明更多的EVs通过抗原受体趋向性而被细胞吸收。Sanger测序结果则证实了CRISPR/Cas9质粒能够通过EVs传递给CD19阳性细胞，导致靶基因发生功能丧失的突变。进一步的小鼠实验也证明了相符的体内状况：CAR修饰后EVs优先积聚在CD19阳性的肿瘤组织中，相比之下，正常EVs在小鼠的整个身体中分布更均匀，且装载有靶向MYC的sgRNA/Cas9的修饰后EVs在体内能诱导肿瘤组织中的细胞凋亡。本项研究使用上皮细胞的EVs作为CRISPR/Cas9系统的投递平台，利用CAR修饰EVs使其对肿瘤具有选择性。与普通EVs相比CAR-EVs在肿瘤中迅速积累并在体内外有效释放靶向MYC癌基因的CRISPR/Cas9系统。综上，EVs和CAR的组合可能是一种新颖的基因治疗投递平台。