基于胡萝卜软腐欧文氏菌基因组信息的农用杀菌活性化合物筛选

欧文氏杆菌（Erwinia）是一种重要的农作物致病细菌，侵染宿主范围广，在世界范围内造成了严重的经济损失。本项目以全基因组测序的胡萝卜软腐欧文氏菌SCRI1043株（Eca SCRI1043）为研究对象，通过构建胡萝卜软腐欧文氏菌的代谢网络，利用网络拓扑结构和流量平衡分析确定1～2种处于网络重要节点、各种生存条件下代谢通量不为零，并且在宿主植物中不存在同源蛋白的酶作为最优作用靶标；然后从天然产物数据库DNP和合成化合物数据库ZINC中通过分子对接高通量虚拟筛选几十种活性化合物；最后将靶标酶进行原核表达，建立生物活性测试系统，在酶和菌体水平测定所筛选杀菌化合物的酶抑制率和杀菌活性，并对靶标酶活性位点进行定点突变以验证靶标酶与抑制剂的相互作用机理。本研究的顺利实施有望获得2～3种具有进一步开发价值的新型杀菌化合物，为研制具有自主知识产权的新型绿色杀菌剂奠定坚实基础。

欧文氏杆菌是一种重要的农作物致病菌，侵染宿主范围广，在世界范围内造成了严重的经济危害。本项目以全基因组测序的胡萝卜软腐果胶杆菌为研究对象，首先构建了胡萝卜软腐果胶杆菌的代谢网络。利用大肠杆菌直系同源基因获得Pcc PC1的代谢草图，结合多个公共数据库中的信息对代谢草图进行补充校正，最终构建的全基因组代谢网络iPC1209包含1209个基因、1113种代谢物及2235个反应。采用细菌表型芯片实验 (PM) 对代谢网络进行验证，PMs实验化合物包含191种碳源、95种氮源、59种磷源及35种硫源，与iPC1209模型代谢通量平衡分析（FBA）预测结果一致性为81%，充分证明构建的代谢网络准确率比较高。. 我们对iPC1209的毒力因子代谢、必需基因等重要功能基因进行预测，利用网络拓扑结构和FBA得到了19个潜在杀菌剂靶标，其中有5个靶标与胡萝卜软腐果胶杆菌的毒力因子代谢有关，超过半数的潜在靶标属于辅酶维生素代谢途径。进一步对2个潜在靶标碱性磷酸酶（Alkaline phosphatas，酶号3.1.3.1）和十一异戊二烯焦磷酸酶（酶号2.5.1.31， UPPS）进行了计算机辅助筛选。碱性磷酸酶在代谢网络中处于重要节点地位，同时也是药物靶标数据库TTD中治疗癌症的成功靶标，但其作为杀菌剂潜在靶标进行研究尚未有相关文献报导。本研究中我们首次探讨碱性磷酸酶作为农用杀菌剂潜在靶标的可能性。首先通过同源建模的方法模建碱性磷酸酶的三维空间结构，然后采用GOLD软件对specs数据库中的小分子进行对接，通过三轮虚拟筛选，进一步目筛得到219个先导化合物，购买到其中89种进行后续活性测试。. 采用牛津杯法对89种化合物进行抑菌实验，筛选到3个有抑制活性的化合物，相应的抑菌圈分别为12mm、15mm、18mm。PCR扩增得到了碱性磷酸酶基因，进而构建碱性磷酸酶表达载体，得到3种化合物的酶活抑制率分别为65.882 ± 1.653 μg/mL, 42.874 ± 1.875 μg/mL, 63.041 ± 1.745 μg/mL，具有一定的酶活抑制率。本课题研究获得了3种有进一步开发价值的新型杀菌化合物，为研制具有自主知识产权的新型绿色杀菌剂奠定了基础。