NOR1基因剔除小鼠模型的构建及其抑瘤功能研究

Oxidored-nitrodomain-containing protein 1 (NOR1) is a novel tumor suppressor (TSG) candidate gene cloned by our laboratory. NOR1 is evolutionarily conserved from Drosophila to humans. Altered NOR1 expression was associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC), testicular cancer and malignant hematopoietic diseases. Our previous works confirmed that ectopic expression of NOR1 in NPC cells inhibited tumor cell colony formation and viability. To investigate the role of the NOR1 gene in mammalian development and tumorigenesis, a null mutation was introduced into the gene by homologous recombination in murine embryonic stem cells to construct the NOR1 knockout mouse model. We used both whole-animal and cell-culture models in which NOR1 expression could be disrupted by genetic techniques. Phenotypes caused by NOR1 gene knockout in mouse would be examined. The effect of NOR1 knockout on cell proliferation, apoptosis, cell cycles and migration ability of the mice embryos fibroblasts (MEF) would be determined. We will also test the effects of malignant transformation ability of Mutant K-ras on NOR1 knockout cells. Carcinogenesis induced by chemical carcinogens and in combination with c-Myc or p53 deletion in NOR1 knockout mouse would be analyzed. The effect of NOR1 knockout on energy metabolism reprogramming would be determined.

NOR1是我室克隆的一个候选的抑瘤基因，该基因在进化上高度保守，在包括鼻咽癌、睾丸癌、白血病等在内的多种肿瘤组织中表达下调，具有抑制肿瘤细胞生长和增殖、促进凋亡的作用。尽管NOR1基因抑瘤功能和作用机制研究取得了一定的进展，但仍然缺乏强有力的体内实验依据。为此本项目通过构建 NOR1基因剔除小鼠模型，全面考察NOR1剔除后小鼠大体表型的改变，确定与NOR1抑瘤功能相关的外在表型或其它新的表型；综合比较NOR1剔除对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）增殖、细胞周期、凋亡、细胞运动、迁移以及突变型K-ras对细胞转化能力等的影响，对小鼠自发性和诱发性肿瘤或与c-Myc、p53-/-杂交后子代鼠自发性肿瘤形成的时间、大小和生存率的影响，从而阐明 NOR1 在小鼠中的抑瘤功能；研究NOR1剔除后对能量代谢重编程及相关信号通路的影响，从而初步揭示NOR1在小鼠中抑瘤的分子生物学机制。

NOR1 是项目负责人课题组自主克隆的一个候选抑瘤基因，该基因在进化上高度保守，在包括鼻咽癌、睾丸癌、白血病等在内的多种肿瘤组织中表达下调，具有抑制鼻咽癌细胞生长和增殖、促进凋亡的作用。本项目采用同源重组策略构建NOR1 基因剔除小鼠模型，通过gDNA PCR、RT-PCR和western blot鉴定表明NOR1基因敲除成功。大体观察发现，NOR1基因敲除不具有胚胎致死性，也不影响小鼠的生殖与发育，但是雄性纯合子小鼠易患睾丸肿大和腹部囊肿。NOR1基因敲除不影响小鼠生长、寿命以及行为。敲除NOR1基因不足以诱发肿瘤产生。在研究过程中我们发现NOR1蛋白在人肝癌组织中表达上调，推测NOR1在肝癌组织中异常表达可能促进了肝癌发生。因此我们利用NOR1基因敲除小鼠研究了二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine, DEN)诱发的小鼠肝癌发生。结果发现，敲除NOR1基因的纯合子小鼠与野生型小鼠相比，DEN诱发的肝细胞癌发生率降低，且DEN诱发的肝癌数目显著下降。DEN诱发的肝细胞癌是一个典型的炎-癌转化过程，敲除NOR1后抑制了DEN诱导的肝脏炎症因子IL-6、TNF-α表达，减少髓系来源的CD11b+细胞浸润，抑制NF-κB的活化，提示NOR1敲除减轻了DEN处理后炎症的强度和炎症细胞的浸润，从而延缓或抑制肝癌发生。我们也采用慢病毒表达系统建立了稳定表达NOR1的人肝癌HepG2细胞系，通过生长曲线测定、平板集落形成以及transwell侵袭小室实验发现，在肝癌细胞中过表达NOR1，并不影响肝癌细胞的生长、增殖和侵袭，说明NOR1并不是通过增强肝癌细胞本身的恶性行为促进肝癌发生。通过免疫荧光检测发现在人肝癌组织中NOR1蛋白与CD163呈共定位；在野生型小鼠DEN诱发的肝癌组织中，也观察到NOR1蛋白与F4/80荧光呈共定位，提示NOR1主要表达在肝癌组织中的巨噬细胞。本研究首次建立了敲除NOR1的基因工程小鼠，并发现NOR1在肝癌组织中的巨噬细胞中表达；敲除NOR1基因，抑制了DEN诱导的肝细胞损伤后炎症反应和炎症细胞浸润，延缓了DEN诱导的肝癌发生，为进一步深入研究NOR1在炎-癌转化中的作用机制打下基础。