禽戊型肝炎病毒VLPs组装的分子基础及其对天然病毒颗粒的模拟特性

The infection of avian hepatitis E virus (HEV) in chickens causes big liver and spleen diseases and egg drop syndrome and is endemic in many countries including China. The diseases cause seriously economic loss in poultry industry and may be zoonosis. Biological and immunological research of avian HEV is hampered because of no efficient cell culture system for the virus propagation. In 2010, we first isolated and sequenced the Chinese avian HEV strain (CaHEV). The expression results of CaHEV capsid protein by baculovirus system showed the protein was divided into some fragments, which were similar as the assembly of HEV-VLPs in the Tn5 cells. Then, based on the methods of HEV-VLPs production, the fragment forming VLPs will be first identified, the key amino acid regions of CaHEV capsid protein for VLPs will be determined and to improve the assembly rate, the molecular foundations will be documented in the grant project. The obtained CaHEV-VLPs will be examined for its antigenicity, immunogenicity, attachment and internalization to cells by the methods of ELISA, immune-electron microscopy, flow-cytometry, IFA and confocal microscopy. This completion of the grant project may provide the experimental materials and foundations for crystal analysis of VLPs and pave the way for development of diagnosis, structure biology and molecular basis of interaction with host cells for avian HEV.

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）感染给养禽业造成严重经济损失，而且可能具有公共卫生学意义。但是，目前禽HEV尚无高效体外培养系统，阻碍了其相关研究。申请人于2010年鉴定第一株禽HEV中国分离株(CaHEV)，杆状病毒表达病毒ORF2基因得到不同大小的蛋白，与人HEV-VLPs表达组装的结果相似。本项目将以此为基础，首先确定上述不同大小蛋白中能够组装为CaHEV-VLPs的蛋白，然后继续截短表达，确定CaHEV-VLPs组装所需衣壳蛋白的关键氨基端区域，解析其组装的分子基础并高效表达；同时运用ELISA、免疫电镜、IFA和激光共聚焦等技术系统分析CaHEV-VLPs抗原性，免疫原性以及对宿主细胞吸附和内化的特性，明确其是否很好模拟天然禽HEV，为禽HEV衣壳蛋白晶体结构解析提供试验材料，并为病毒诊断、复制蛋白组装机和与宿主细胞相互作用的分子机制研究奠定基础。

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）感染给我国养禽业造成严重的经济损失。但是由于该病毒尚无高效体外培养系统，严重阻碍了其相关研究。近年来，类病毒颗粒（Virus like particles, VLP）已被证明可作为一种有效替代天然病毒的工具，研究病毒结构和功能的关系以及病毒结构蛋白在致病过程中所起的作用。因此，制备能够模拟天然病毒的禽HEV-VLPs可以解决因为没有高效的体外培养系统对禽HEV研究造成的一系列困难。基于此，项目的主要研究内容包括确定禽HEV-VLPs组装所需ORF2蛋白的关键氨基酸区域，并高效表达制备；分析禽HEV-VLPs的抗原性、免疫原性以及对宿主细胞的吸附和内化的特性。通过项目的实施，成功确定了禽HEV ORF2蛋白56-554氨基酸区域在杆状病毒表达可自我组装成禽HEV-VLP，并分泌到昆虫细胞培养上清中；而313-549氨基酸区域在大肠杆菌中表达，透析复性后，也可自我组装成VLP。同时优化了ORF2蛋白原核表达的密码子以及表达、透析条件，提高了VLP组装表达量，1L大肠杆菌大约可制备30mg的VLP。进一步的抗原性和免疫原性分析发现，VLP作为抗原可以高效的血清学诊断鸡只中天然禽HEV感染，而且VLP也能够刺激机体产生强烈的免疫应答反应，并且产生的抗体可以与天然病毒发生特异性的结合，因此制备的VLP可以作为禽HEV血清学诊断抗原和疫苗设计免疫原的靶蛋白。此外，宿主细胞吸附实验证明，制备的VLP可以很好地模拟天然病毒颗粒，吸附禽肝癌细胞系LMH，并能够内化进入细胞质中。综上，项目成功完成了预期的研究内容，成功表达和制备了禽HEV-VLP，并且VLP可以很好模拟天然病毒颗粒的抗原性以及吸附宿主细胞的特性，为禽HEV疫苗的研发以及致病机理的研究奠定了坚实的材料基础。