维生素D代谢关键酶CYP24A1对上皮型卵巢癌增殖和浸润能力的影响

The observed epidemiologic studies suggest that deficiency of vitamin D is the risk of epithelial ovarian cancer (EOC). Researches from in vitro and in vivo demonstrate that vitamin D inhibit cell proliferation and migration of EOC. However, some studies on randomized controlled trial agree to differ on this point. Our preliminary results suggest that overexpression CYP24A1, key enzyme of vitamin D metabolic, was inversely associated with of malignancy grade of EOC. Moreover, 1 alpha,25(OH)2D3, active of vitamin D, increased the mRNA expression of CYP24A1 with 15000 times in malignant transformation of ovarian epithelial cells. We hypothesis whether reduced-expression of CYP24A1 enhances effect of vitamin D on development and aggressiveness of EOC. Therefore, in the current project, we are aiming to systematically investigate the effect of CYP24A1 on the proliferation and migration of SKOV-3 and OVCAR-3 cells. We investigate that knockdown expression of CYP24A1 used by CRISPR/Cas9 enhanced 1alpha,25(OH)2D3 -mediated antitumor effect in ovarian cancer cells in vitro and tumorigenicity in vivo. Tumor tissues of patients with EOC are used to verify that inhibition of CYP24A1 enhances 1 alpha,25(OH)2D3 -mediated antitumor effect. We also analysis the change of components (CYP27B1and vitamin D receptor) in vitamin D endocrine system in both increased and decreased expression of CYP24A1. In addition, chromatin immunoprecipitation and pull-down mass spectrometry are used to reveal that key different genes and proteins are correlated with both endogenous and inductive CYP24A1. Our results will be helpful to understand the molecular mechanisms underlying the therapeutic role of vitamin D in development and aggressiveness of EOC, which will provide new clues to find the new measures of preventing and treating ovarian cancer.

观察流行病研究提示维生素D缺乏是卵巢癌发病的危险因素。细胞和动物实验也证实维生素D可以抑制卵巢癌的发生。但是维生素D干预的人群试验研究得出的结论却不一致。课题组前期研究发现活性维生素D降解酶CYP24A1在上皮型卵巢癌患者肿瘤组织表达明显升高，而且活性维生素D干预可以引起CYP24A1表达诱导性升高。受上述实验结果的启发，课题组认为减少CYP24A1表达可能会提高维生素D对上皮型卵巢癌增殖和浸润的抑制作用。为验证这一科学问题，本项目使用CRISPR/Cas9技术减少CYP24A1的表达，通过细胞和动物实验以及人上皮型卵巢癌患者术后的肿瘤组织等研究体系，观察CYP24A1对上皮型卵巢癌增殖和浸润能力的影响。同时利用ChiP和pull-down 质谱技术研究与CYP24A1相互作用的关键基因和蛋白质，进一步完善维生素D与卵巢癌联系的理论，为维生素D更合理地用于卵巢癌防治提供理论和实验依据。

观察流行病研究提示维生素D缺乏是肿瘤发病的危险因素。细胞和动物实验也证实活性维生素D可以抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭。但是维生素D干预的人群试验研究得出的结论却不一致。课题组前期研究发现活性维生素D降解酶CYP24A1在上皮型卵巢癌患者肿瘤组织表达显著升高，而且活性维生素D干预引起CYP24A1诱导性升高。为了研究内源性CYP24A1是否具有癌基因样功能，是否影响维生素D抗肿瘤作用，本项目主要开展以下三方面研究。第一，内源性CYP24A1对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。体内和体外实验发现，减少内源性CYP24A1表达显著抑制卵巢癌和肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而增加外源性CYP24A1表达却促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。实验发现CYP241A可能与RNA结合蛋白FUS直接相互作用，降低FUS与miR-200c的表达水平，减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用，从而通过上调Vimentin、Snail和下调E-cadherin促进EMT过程；第二，抑制CYP24A1表达对活性维生素D抗肿瘤作用的影响。实验结果显示诱导性CYP24A1启动子转录上调主要与活性维生素D处理时间有关，与药物浓度关系不大。减少内源性CYP24A1并没有减弱活性维生素D对CYP24A1的诱导程度，但是，却可以提高活性维生素D抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的能力，其原因有待于进一步探讨；第三，CYP24A1对活性维生素D影响肿瘤细胞的化疗和放疗敏感性。实验发现过表达CYP24A1抵抗活性维生素D抑制卵巢癌细胞增殖的作用，但是不影响卡铂的抑制作用，也没有减弱联合处理组对卵巢癌细胞增殖和迁移的抑制作用。减少CYP24A1不仅提高活性维生素D抑制卵巢癌细胞增殖的能力，同时提高活性维生素D与卡铂的联合作用效果。另外，体内和体外实验也证实，活性维生素D通过激活NAPDH/ROS通路提高肿瘤细胞的辐射敏感性。总之，本研究结果表明内源性CYP24A1具有癌基因样作用，与其激活FUS/miR-220c/ZEB1通路促进EMT有关；减少维生素D代谢酶CYP24A1可以提高活性维生素D的抗肿瘤作用，活性维生素D增加肿瘤细胞化疗和放疗敏感性。本研究结果为为进一步研发CYP24A1的特异性抑制剂提供可靠的实验数据，完善维生素D防治肿瘤的机理。