应用基因敲除小鼠研究维生素D信号通路在卵巢癌发生过程的作用

流行病学资料提示太阳光照射和血浆25-羟维生素D含量与卵巢癌发生呈负相关，但是其作用机制不清楚。本项目以维生素D受体基因敲除小鼠为模型，研究维生素D在卵巢癌发生过程中的作用。使用已建立的小鼠卵巢表面上皮细胞培养体系，比较基因敲除鼠和野生型鼠卵巢表面上皮细胞体外转化能力和细胞表型等方面的异同，研究维生素D对卵巢表面上皮细胞恶性转化的保护作用，并寻找维生素D信号通路在卵巢上皮细胞转化过程中作用的靶点。另外，利用基因敲除鼠体内活性维生素D水平是同窝野生型鼠9倍的现象，把体外已发生恶性转化的卵巢表面上皮细胞移植到不同基因型小鼠内，观察已转化的卵巢表面上皮细胞在基因敲除和野生型小鼠体内的成瘤性；同时在不同基因型小鼠的卵巢包膜下注射DMBA，研究阻断维生素D信号通路后体内卵巢组织的恶化过程及机理,全面分析维生素D信号通路在卵巢癌发生中的保护作用及机制，为维生素D用于卵巢癌防治提供科学依据。

流行病学资料提示太阳光照射和血浆25-羟维生素D含量与卵巢癌发生呈负相关，但是其作用机制不清楚。本项目首先建立小鼠卵巢表面上皮细胞（MOSECs）分离、鉴定和体外培养方法，观察到活性维生素D[1,25(OH)2D3]通过推迟小鼠卵巢表面上皮细胞转化灶形成和接触抑制生长消失的时间，以及减少其克隆形成率，延缓DMBA诱发MOSECs的恶性转化，这种作用与上调维生素D受体（VDR）和E–cadherin的表达以及下调beta-catenin的表达有关。同时，使用原位注射DMBA法建立的小鼠卵巢癌模型，实验结果显示维生素D降低了小鼠血清及腹水中肿瘤标志物CA125的含量，小鼠卵巢癌的发生率与血清25-羟维生素D水平呈负相关。虽然维生素D可以在肿瘤的起始或促长阶段减少小鼠卵巢癌的发生，但还是在肿瘤的整个发展过程给予维生素D处理能达到最好的防治效果。并且发现维生素D减少小鼠卵巢癌的发生与增加VDR和E-cadherin表达以及减少beta-catenin的表达有关。最重要的是本研究还发现小鼠卵巢表面上皮细胞在体外长期培养过程中，可以自发地发生恶性转化，染色体倍数由二倍体转变为四倍体和超四倍体，MOSECs的平板克隆形成率随着传代次数的增加而增加，在MOSECs传至第85代时，观察到细胞恶性转化的软琼脂克隆形成。晚期MOSECs接种于裸鼠后30d，就可以触及到皮下明显的肿块，病理学检测结果表明此肿块是肿瘤组织。此现象为更好地了解小鼠卵巢表面上皮细胞恶性转化各阶段特征，及深入研究上皮细胞性卵巢癌的发生发展机制提供了新的实验模型。另外，本研究还发现1,25(OH)2D3可以明显降低人卵巢癌细胞SKOV-3的存活率，并且与卡铂联用时表现出不同程度的协同作用。实验中还发现1,25(OH)2D3不同的应用顺序对细胞抑制率有明显的影响，先加1,25(OH)2D3后再加卡铂的细胞抑制率明显高于加卡铂后再加1,25(OH)2D3。这为临床联合用药顺序提供了实验基础。1,25(OH)2D3也可以显著增强gamma射线对SKOV-3细胞的抑制作用，其作用机理可能与通过细胞阻滞于G0/G1期，并与gamma射线联合作用时进一步阻滞在G2/M期的双重阻滞作用，以及增加细胞内ROS释放和Ca2+浓度，诱导细胞凋亡等有关。为以后1,25(OH)2D3抑制卵巢癌及增强放疗作用方面的机制研究提供了实验基础。