转录因子GFI1和LMO4与小分子RNA对毛细胞分化的作用及分子机制

In the previous study, our research group established zebrafish Gfi1 and Lmo4 gene knock-down models by morphilino modified antisense oligonucleotide (MO) injection for the first time. The abnormal phenotypes of inner ear and hair cells in early stage of zebrafish development suggested that Gfi1 and Lmo4 played critical roles in the inner ear development. This project intends to focus on the effects of transcription factors Gfi1 and Lmo4 in differentiation of hair cells, and finding their upstream and downstream genes to explore the interaction between genes, eventually establishing molecular regulatory networks. We will use inner ear stem cell lines derived from otocysts of mouse embryos as models to further testify the effects of Gfi1 and Lmo4 in vitro. We will also look for microRNAs which participate in post-transcription regulation of Gfi1 and Lmo4, and verify their effects on hair cell differentiation in cell models. In this project, we will use two model animals to discuss the molecular mechanism of transcription factors and microRNAs in differentiation of hair cells in either the animal level or cell level.

在前期研究中本课题组通过吗琳环寡聚核苷酸显微注射斑马鱼胚胎介导的翻译抑制首次得到了Gfi1和Lmo4表达下调的斑马鱼动物模型，观察到内耳发育异常及毛细胞数量的减少，提示Gfi1和Lmo4在内耳发育中扮演重要角色。本课题拟重点研究转录因子Gfi1和Lmo4在毛细胞分化过程中的作用，寻找其上下游基因，探讨基因相互作用关系，建立相关分子调控网络。将利用由小鼠胚胎听囊细胞形成的内耳前体干细胞系作为体外研究毛细胞分化的细胞模型，在细胞层面进一步验证Gfi1和Lmo4在毛细胞分化过程的作用。寻找调控Gfi1和Lmo4基因翻译的microRNAs，并通过在听囊细胞内microRNA不同水平的表达验证microRNAs对毛细胞分化的影响。本课题选用两种模式动物相结合，在动物水平和细胞水平共同探讨转录因子及microRNAs在毛细胞分化过程中的相关性及分子机制。

耳聋是最常见的感觉障碍性疾病，其中80%为感音神经性聋，遗传突变是其重要病因。miRNAs对内耳毛细胞和螺旋神经元细胞正常发育、存活有调节作用，对保持正常听觉功能十分重要，已有研究证明miRNA异常可能是导致人和小鼠听力损失的原因之一。本课题选择以已知耳聋基因EYA4作为靶基因的miR-431作为研究对象，拟研究miR-431对耳蜗功能的影响。主要采用Real-time PCR和microRNA原位杂交技术确定miR-431在小鼠耳蜗的时空表达谱。利用已构建的miR-431转基因（Transgenic，Tg）小鼠，进行听性脑干反应（ABR）测试评估小鼠听力，在动物水平了解miR-431对耳蜗功能的影响。利用小鼠基底膜铺片和耳蜗切片等技术探求miR-431转基因小鼠导致听力下降的耳蜗结构变化。利用PC12细胞和原代培养的新生小鼠螺旋神经节细胞，在细胞水平进一步验证miR-431对神经元发育和分化的影响。应用生物信息学软件预测并利用双荧光素酶报告基因系统明确miR-431的靶基因。并在斑马鱼中研究Eya4对内耳发育的影响，以进一步明确miR-431的作用机制。本研究发现miR-431在新生小鼠的耳蜗中的螺旋神经节、Corti器和血管纹中高表达，表达量随小鼠发育而逐渐减少。检测了A和B两个系13周龄的 miR-431 Tg小鼠和同窝的野生型（Wildtype，Wt）小鼠的听力，miR-431 Tg小鼠听觉反应域明显高于Wt小鼠。miR-431 Tg小鼠螺旋神经节细胞分布较Wt小鼠稀疏，石蜡切片上测量 Rosenthal小管中螺旋神经节细胞密度显示，miR-431 Tg小鼠明显低于Wt小鼠。双荧光素酶报告基因系统证实Eya4是miR-431的一个靶基因，且western blot检测显示miR-431 Tg小鼠耳蜗中 EYA4蛋白的含量减少。在PC12细胞中过表达miR-431抑制 PC12细胞的分化。同时miR-431 Tg小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞成熟神经元数量和轴突长度降低。Eya4 基因被下调后引起斑马鱼内耳发育异常。本研究首次发现了miR-431在小鼠耳蜗中过表达可导致小鼠听力下降，并探讨了miR-431调控耳蜗功能的可能分子机制，为遗传性耳聋的预防和治疗提供理论基础。