通过BRET方法研究BST-2与Vpu跨膜区相互作用

The host restriction factor BST-2 was indentified to be responsible for the inhibition of enveloped virus release include HIV-1, and HIV-1 accessory protein Vpu can specific target it and efficiently antagonize this restriction. This complete process of Vpu counteracting BST-2 is based on the interaction between BST-2 and Vpu. Blocking Vpu mediated down-regulation of BST-2 is viewed as a new opportunity for developing anti-HIV drugs. Based on previous study in the interaction of BST-2 and Vpu, we plan to utilize Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) approach to identify the key amino acids of the two transmembrane (TM) domains for their interaction. Next, we will utilized BRET approach to identify small molecules that antagonized HIV-1 Vpu function and restore the BST-2 cellular levels. In general, the achievement of the research work in the proposal will identify the critical amino acids of BST-2 and Vpu at transmembrane domains responsible for their interaction and discovery small molecules that influence the interaction between BST-2 and Vpu, can promote the basic study of Vpu mediated down-regulation BST-2, benefit the application for developing anti-HIV drugs.

BST2是最近发现具有广谱抑制病毒颗粒释放的宿主限制因子，其表达可以显著抑制HIV-1等病毒颗粒从感染细胞释放，而HIV-1病毒蛋白Vpu通过跨膜区与BST-2的相互作用，下调细胞BST-2，阻断其对病毒的抑制作用。阻断Vpu降解BST-2为抗HIV-1及其他病毒药物提供了一种新研发的思路。依据前期工作基础，我们拟建立检测BST-2与Vpu相互作用手段（生物发光共振能量转移，BRET），系统全面检测位于BST-2与Vpu跨膜区相互作用位点，找到具有关键作用的氨基酸。同时运用BRET检测体系，筛选可以干扰Vpu与BST-2相互作用，阻止其下调BST-2的小分子化合物。该项目的研究不仅可以找到位于BST-2与Vpu跨膜区相互作用关键氨基酸位点，找到干扰BST-2与Vpu相互作用小分子化合物，而且通过对小分子化合物筛选也可以明确两者的相互作用机制，为抗艾滋病药物研发提供新的思路和靶点。

BST-2（HM1.24，tetherin，CD317）是一种干扰素诱导蛋白，具有抑制囊膜病毒释放的作用，其抗病毒作用可被HIV-1的辅助蛋白Vpu所拮抗，这种拮抗作用由二者跨膜区的相互作用介导。我们应用生物发光共振能量转移（BRET）方法，在活细胞内重现BST-2和Vpu之间的相互作用。通过对两种蛋白质的整个跨膜区分别进行联合及单点突变，利用BRET信号的变化鉴定出它们相互作用的关键氨基酸位点，并验证这些影响相互作用的关键位点也影响了Vpu对BST-2的拮抗作用。随后，我们基于BRET方法建立了BST-2和Vpu在细胞内稳定共表达的细胞系，并将其作为一种高通量筛选工具，针对两种蛋白质跨膜区相互作用这样一个潜在的药物靶标，筛选出了小分子化合物PR，可以干扰BST-2与Vpu的相互作用。.在我们研究中发现在流感病毒(A/WSN/33, H1N1)感染后，细胞内的BST-2水平发生明显的降低。基于此现象，我们推测流感病毒蛋白中具有可以与BST-2发生相互作用的蛋白，开展了流感病毒中编码蛋白是否具有拮抗宿主限制因子BST-2能力的研究，鉴定流感病毒M2蛋白可以降低BST-2在细胞内和细胞膜上的表达水平。进一步发现缺失M2蛋白表达流感病毒可以更好的被BST-2所抑制。该项工作对流感病毒逃避宿主免疫提出了新的线索。