跨膜蛋白DAP12的合成、性质及其跨膜区相互作用的分子机制研究

跨膜区相互作用机制的研究对于阐述跨膜蛋白跨膜信号传导的机理具有非常重要的意义。本课题旨在建立新型跨膜蛋白合成方法的基础上研究跨膜蛋白DAP12及其受体跨膜区相互作用的分子机制。针对跨膜区的高度疏水性而导致跨膜蛋白易自聚产生沉淀的难点，结合生物学蛋白表达方法和化学固相多肽合成方法两者的优势，建立新型和高效的跨膜蛋白DAP12及其受体的嵌段耦合合成新方法，同时将该方法扩展到普通生物方法难以表达的其它跨膜蛋白及其翻译后修饰比如磷酸化、糖基化和脂基化等的合成。并以此为契机，进一步研究跨膜蛋白DAP12及其受体跨膜区之间以及跨膜区与细胞膜之间的相互作用方式、作用原理和作用的基本分子机制，从而为探讨跨膜区相互作用在跨膜信号传导中所起的关键作用提供理论依据。

跨膜区相互作用分子机制的研究对于阐述跨膜蛋白跨膜信号传导的机理具有非常重要的意义。鉴于免疫系统中跨膜蛋白DAP12和其相关受体跨膜区的相互作用对于理解免疫信号的跨膜传导至关重要，本项目首先结合生物学蛋白表达方法和化学固相多肽合成方法两者的优势，建立新型和高效的跨膜蛋白DAP12及其受体的合成新方法，并且结合圆二色谱和SDS-PAGE方法确定了DAP12跨膜区的二聚作用。其次本项目建立在大肠杆菌细胞膜环境中跨膜蛋白DAP12跨膜区相互作用的体内（In vivo）研究方法，并且结合基因定点突变技术，确定了决定DAP12跨膜区相互作用的关键氨基酸——极性氨基酸相互作用。接着本项目建立计算机模拟研究跨蛋白跨膜区相互作用的体系与分析数据的方法，结合应用全原子模拟以及粗粒化模拟方法从原子水平上确定了参与DAP12跨膜区相互作用的关键氨基酸的相互作用方式、作用原理和作用的基本分子机制。在此基础上，进一步在粗粒化模拟中引入针对极性相互作用的力场，深入研究了DAP12二聚体与其受体NKG2C的相互作用位点和分子机制。首次确定了DAP12与受体NKG2C之间只能以2：1的比例形成稳定的三聚体，而不能形成稳定的四聚体。通过分析关键残基的相互作用得出结论，在DAP12-NKG2C-DAP12的三聚结构中，DAP12二聚体上的两个天冬氨酸与NKG2C上的赖氨酸作用是对称的，并首次确认了苏氨酸在稳定三聚体构象中起到的重要作用。基于我们的实验和模拟计算结果，我们首次提出了跨膜蛋白DAP12及其相关受体的自组装相互作用原理图，从而为探讨跨膜区相互作用在跨膜信号传导中所起的关键作用提供理论依据。