树鼩精子获能与顶体反应的分子基础及调控机制

Due to its genetically close relationship to primates and many other unique characteristics, the tree threw has been proposed as an alternative experimental animal to precious primates in biomedical research. Quite a few fundamental biological data on tree threws have been published. However, no research on sperm capacitation, acrosome reaction (AR) and their molecular mechanisms for this animal has been reported in PubMed. This situation inevitably will become the bottle neck that restricts tree threws' wide use in disease mechanism and new drug development. Our preliminary study demonstrates that sperm capacitation of tree threw is accompanied by tyrosine phosphorylation in a subset of proteins, and this process is a cAMP-PKA dependent signaling pathway that is reliant on time period, BSA, Ca2+, HCO3- during sperm capacitation. The result provides a good basis for our further understanding the molecular mechanism of sperm capacitation in tree threws. In addition，we find proteins of SRC and ADF/cofilin in the mature tree threw sperm. Thus, we hypothesize that the interreaction among SRC, ADF/cofilin, PLCγ and PIP2 is responsible for AR regulation in tree threws. The present proposal is of great theoretical and realistic significance as it will facilitate the development of reproductive and developmental biology of tree threws.

树鼩因与灵长类最近的亲缘关系和诸多独特的特点，在生物医学研究中被认为是最有望于替代珍贵的灵长类动物之新型实验动物。现有文献报道了相当多的树鼩基础生物学数据，但是树鼩精子获能、顶体反应及其分子机制方面的研究，迄今尚未见有PubMed 收录论文发表，这势必会成为制约树鼩在疾病机理研究和新药研发中广泛应用的瓶颈。我们的前期工作表明树鼩精子获能伴随有蛋白质酪氨酸磷酸化，此过程为时间、BSA、Ca2+、HCO3-依赖性的cAMP-PKA信号转导途径，研究结果为进一步研究树鼩精子获能的分子机制奠定了良好的基础；我们还发现树鼩成熟精子中有SRC和ADF/cofilin蛋白表达，因此，我们提出"SRC、ADF/cofilin、PLCγ以及PIP2相互作用，完成对树鼩精子顶体反应的调控"之假说。本项目能够促进树鼩生殖与发育生物学的发展，具有重要的理论意义和现实意义。

树鼩被认为是最有望于替代珍贵的灵长类动物之新型实验动物，现已报道了很多树鼩基础生物学数据，但树鼩精子获能与顶体反应及其分子机制方面的研究，迄今未见PubMed论文发表，这可能会成为树鼩研究与应用的制约因素。该项目通过系统研究，阐明了树鼩精子获能的基本条件及几种关键分子，首次成功建立了树鼩精子体外获能体系；阐明了树鼩精子体外获能伴随有蛋白酪氨酸磷酸化的发生，但发生酪氨酸磷酸化的蛋白数量远低于已报道的绝大部分物种，其获能的最佳时间为8h；阐明了BSA、HCO3ˉ、Ca2+三种关键分子在树鼩精子获能中的调控机制，发现BSA在树鼩精子获能中通过引发精子膜胆固醇外流，增加膜流动性和渗透性，进而促进获能，而甲基环糊精和丙基环糊精也可以替代BSA促进树鼩精子获能；发现HCO3ˉ通过CFTR而起作用，对树鼩精子获能进行调控；对Ca2+调控树鼩精子获能的作用机制进行了详尽的研究，发现与已报道的绝大部分物种精子不同，外源Ca2+对大部分树鼩精子蛋白的酪氨酸磷酸化具有抑制作用，但其是树鼩精子获能的必需成分；探明了树鼩精子获能为cAMP-PKA依赖的细胞信号转导途径；成功建立了树鼩精子顶体反应诱导及检测方法，发现SRC、ADF/cofilin、actin、Ca2+等为参与树鼩精子顶体反应的重要分子，探究了其对顶体反应的调控机制，发现SRC和ADF/cofilin在顶体反应前后发生磷酸化/非磷酸化改变，发现PLC受抑制时，树鼩精子顶体反应发生率显著下降；此外，还首次克隆出树鼩Tssk基因家族五个成员cDNA的全长序列，将其提交至GenBank，并获得相应登录号；进行了Tssk蛋白的体外表达，获得相应的重组蛋白；构建了树鼩Tssk基因在其11种组织/器官中的表达谱，研究结果表明树鼩的Tssk基因特异表达于睾丸组织和/或精子中，但Tssk基因五个成员的表达情况存在差异；对克隆所得的树鼩Tssk基因进行生物信息学分析，获得诸多树鼩Tssk蛋白的理化特性、结构和功能等方面的基础数据。.由于树鼩与灵长类甚至人类高度相似，本项目的研究成果对探讨相关人类生殖问题具有重要的借鉴作用。