基于ERα/GPR30信号通路的黄芩素抗乳腺上皮细胞转化的研究

Breast epithelium transformation induced by estrogen is the key process in breast carcinogenesis. It is confirmed that selective estrogen receptor (ERα) modulator could interfere this process, however, pure ERα antagonist is inactive to ER-negative breast cancer and long time exposure to this kind of drug conducts to occurence of breast cancer risk. Some investigations suggested that it is related to GPR30 singaling transduction. Baicalein, one flavonoid derived from the root of Scutellaria baicalensis Georgi, has been reported for its anti-cancer activity of breast cancer. Molecular modeling and binding experiments showed that there is a good affinity of the ERα and GPR30 ligand binding domian for the baicalein, which implied the potential agonist/antagonist activity of baicalein exerted through ERα and GPR30. We construct the model of transformation induced by 17β-estradiol (E2) to evaluate the effect of baicalein on transformation and the biological action exerted through ERα and GPR30. The detail molecular mechanisms analyses containing, ERα singaling including, ERα expression, cytoplasm/nucleus distribution, transactivation and gene expression induced by E2; and GPR30 singaling including, GPER-mediated EGFR, ERK/Akt activation gene transcription. In general, our project performed the investigation of baicalein on ERα and GPR30 could represent an innovative pharmacological approach targeting breast carcinomas which express one or both receptors at the beginning and/or during tumor progression.

雌激素诱导的乳腺上皮细胞转化是乳腺癌发生的关键步骤。ERα选择性拮抗剂可干预这一过程，但单纯抑制ERα信号通路对ER阴性乳腺癌无效，且长期使用容易产生耐药和病情恶化，这可能与激活GPR30有关。黄芩素具有抗乳腺肿瘤的活性，我们通过分子对接发现该化合物与ERα和GPR30结构的LBD域具有较强的结合能力，提示黄芩素可能对两种受体的信号通路产生影响。在本项目中，我们通过构建雌激素诱导的细胞转化模型，考察黄芩素对这一过程的抑制作用，同时考察黄芩素对ERα表达和浆/核分布、激活ERE及其靶基因转录表达的影响，以及对GPR30的表达、GPR30介导的EGFR转活、下游ERK和Akt的活化及相关基因表达的影响，研究黄芩素能否同时通过影响ERα和GPR30两条信号通路，来干预雌激素诱导的乳腺上皮细胞转化。本项目为研究天然黄酮化合物预防乳腺癌发生提供了新的思路，具有一定的理论意义和临床应用前景。

乳腺癌作为一种激素依赖性肿瘤产生于乳腺上皮。乳腺上皮细胞长期接受雌激素（17β-estradiol, E2）的刺激会发生恶性转化（transformation），进而促进乳腺癌的形成和发展。流行病学研究表明，黄酮化合物的摄入能够降低乳腺癌发生的风险，但原因尚不明确。在项目研究的过程中，我们通过构建E2长期诱导乳腺上皮细胞转化的模型，评价黄芩素对该环节的抑制作用。结果表明黄芩素能够抑制MCF-12A和MCF-10A乳腺上皮细胞获得E2长期诱导下具有的生长加快、迁移能力增加以及侵袭能力。基质胶（matrigel）三维培养研究表明，E2长期诱导后细胞不再具有分化能力，在基质胶培养条件下会形成实体的无序官腔球状结构，而在黄芩素的作用下乳腺癌上皮细胞与对照组类似，能够分化形成中空腺泡的三维导管样（ductule-like）结构，黄芩素能够抑制E2破坏乳腺癌上皮细胞形成正常的导管结构。软琼脂糖克隆形成实验以及NOD/SCID裸小鼠移植瘤模型的结果表明，黄芩素对E2诱导的乳腺上皮细胞在体外、体内的成瘤能力均具有抑制作用。采用SWISS-MODEL和Sybyl-X 1.2软件通过蛋白数据库构建同源晶体模型（ERα PDB ：3ERT；GPR30 PDB：1G50）并进行对接分析，结果发现黄芩素与雌激素受体ERα和GPR30的LBD域具有较强的结合能力，提示黄芩素可能对这两种受体信号通路产生影响。进一步的研究表明，黄芩素能够通过抑制E2诱导下ERα在细胞核内分布增多、与雌激素受体反应元件（ERE）的结合增强，以及ERα靶基因pS2和cyclin D1的转录活性增强，发挥抑制E2介导的ERα核受体信号通路激活的作用。此外，黄芩素还能够抑制E2诱导的GPR30下游EGFR 1173位酪氨酸、ERK 202和204位酪氨酸以及Akt 473位丝氨酸的磷酸化；并抑制E2诱导的Src激酶416位酪氨酸的磷酸化，以及EGF诱导的EGFR受体磷酸化，抑制E2诱导的GPR30对EGFR的转活；黄芩素对E2诱导的GPR30下游c-fos、CTGF、EGR1和CRY61基因mRNA的表达上调也具有抑制作用。本研究明确了黄芩素对E2诱导乳腺上皮细胞恶性转化的保护作用，阐明了其同时抑制ERα和GPR30受体信号通路的作用机制，为该化合物的应用提供了新的理论依据，并且为寻找预防乳腺癌的新药研究提供参考。