基于PERK内质网应激信号通路探讨黄芩素在糖尿病肾病中的抗凋亡机制

Renal cell apoptosis is thought to contribute to proteinuria production and the disease progress of diabetic nephropathy.Endoplasmic reticulum stress(ERS) is an upstream event of apoptosis.PERK is one of the endoplasmic reticulum stress signaling pathways and PERK-CHOP pathway play a proapoptotic role in kidney disease. Chinese herb monomer baicalein exert anti-apoptotic activites for non-neoplastic cells. Our previous results demonstrated that baicalein ameliorate renal injury in experimental diabetes and PERK endoplasmic reticulum stress signaling pathway is activated in diabetic kidney.In this study,PERK is down-regulated by PERK siRNA,and baicalein is then used to interfere in vivo and in vitro.The effct of PERK for the cell apoptosis in diabetic kidney was investigated.The objective of this study is to clarify the role of PERK pathway activation for cell apoptosis in diabetic kidney,and to define whether diabetic renal protective effect of baicalein is dependent on its inhibition of the PERK signaling pathway. The significance of this project is to provide new targets Chinese medicine prevention for diabetic nephropathy,and to clarify the partial mechanisms that baicalein protect the diabetic kidney.

肾组织细胞凋亡在糖尿病肾病蛋白尿形成和病情进展中发挥重要作用，内质网应激是诱导细胞凋亡重要的上游事件,PERK是内质网应激重要信号通路之一，PERK-CHOP信号通路活化在肾脏疾病中发挥促凋亡作用。中药单体黄芩素在非肿瘤性组织细胞表现为抗凋亡作用。本项目基于课题组的前期工作：即黄芩素对糖尿病大鼠肾脏具有一定保护作用，糖尿病大鼠肾组织存在PERK内质网应激信号通路活化的研究结果，拟采用RNA干扰技术下调PERK基因表达，并应用黄芩素进行干预，通过体内和体外实验，观察其对糖尿病肾组织细胞凋亡的影响。旨在明确PERK内质网信号通路活化在糖尿病肾组织细胞凋亡的作用，及黄芩素的糖尿病肾脏保护作用是否依赖于其对PERK信号通路的抑制效应。本课题的意义在于为糖尿病肾病的中药防治提供新靶点，并阐明黄芩素的部分糖尿病肾病保护机制。

项目背景：肾组织细胞凋亡在糖尿病肾病蛋白尿发生和进展中发挥重要作用。PERK信号通路活化在肾脏疾病中发挥促凋亡作用。黄芩素在非肿瘤细胞表现为抗凋亡作用。本课题旨在为糖尿病肾病的中药防治提供新靶点，并阐明黄芩素的部分糖尿病肾病保护机制。.研究内容：（1）通过建立链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠模型，治疗组分别给予黄芩素75，150，300 mg/kg/d 灌胃。共观察24周。检测各组大鼠血糖，血压，24小时尿白蛋白定量，肾重/体重，肾脏病理。TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组织化学检测肾组织PERK,eIF2α，GRP78，CD68,细胞间黏附分子-1,E选择素的蛋白表达水平。RT-PCR 检测各组大鼠肾组织MCP-1,IL-1，TNFα的表达水平。（2）不同糖浓度刺激HK-2细胞24h，观察细胞活力变化和内质网应激相关蛋白PERK, eIF2α，GRP78，IκBα和p65蛋白表达规律。45mM浓度的葡萄糖刺激HK-2细胞24h，观察不同剂量黄芩素（25-100uM)对高糖诱导的HK-2细胞活力变化和内质网应激相关蛋白及炎症通路激活和细胞外基质的影响。.重要结果及关键数据: （1）糖尿病组和治疗组血糖明显高于正常组，但治疗组和糖尿病组差异无显著性。各组大鼠之间血压差异无显著性。糖尿病模型组肾重/体重，尿白蛋白水平均显著高于正常组，300 mg/kg/d黄芩素治疗组尿白蛋白水平均较模型组降低。300 mg/kg/d黄芩素治疗组可以减少糖尿病大鼠肾小球硬化和肾小管损伤，细胞凋亡。糖尿病模型组肾组织PERK,eIF2α，GRP78，MCP-1,IL-1，TNFα，细胞间黏附分子-1，E选择素的表达水平均显著高于正常组，300mg/kg/d黄芩素治疗组可以明显降低以上指标的表达水平，差异有显著性。（2）高糖诱导的HK-2细胞毒性损伤呈一定的浓度依赖关系。高糖能够刺激HK-2细胞PERK, eIF2α，GRP78，IKKα/IκBα/p65通路激活，及促进ECM成分堆积。黄芩素可以通过抑制高糖诱导的HK-2细胞PERK, eIF2α，GRP78，IKKα/IκBα/p65通路激活，减少ECM成分堆积。.科学意义:黄芩素可能通过减轻糖尿病肾脏内PERK内质网应激和炎症进程来延缓糖尿病肾病进程。