具有TLR2激活作用的新型脂肽的发现及其佐剂活性的研究

Bacteria lipopeptides, as candidates of vaccine adjuvants, are proved to be capable of improving the immunogenicity of vaccine antigens, and effectively stimulating the host mucosal immune response. However, the adjuvant effect of existing lipopeptides is still not ideal. The current project intends to use both the synthesis method and the extraction method to discover novel lipopeptides. The synthesis methods is to rational design and synthesize new non-natural lipopeptide to simulate the active site of the bacteria lipoprotein which activate TLR2; the extraction method is to extract, isolate and identify novel natural lipopeptides from bacteria culture fluid. For the lipopeptides obtained from the above two methods, we intend to in vitro evaluate their TLR2 activity and the safety, and carry out structure-activity relationship analysis to determine the main structural factors which afffect the activity. In further, the in vivo adjuvant activityeffect of the lipopeptides on the immune response to ovalbumin and helicobacter pylori vaccine will be evaluated. The immune response characteristics and the protective effect will also be determined. Based on the above findings, we aim to discovery of novel lipopeptides with better adjuvant activity, which may lay the foundation of the development of novel lipopeptide adjuvants.

细菌脂肽可以提高疫苗抗原的免疫原性，并有效激发粘膜免疫应答，是疫苗佐剂的候选分子。然而，现有细菌脂肽的佐剂活性仍不理想。本项目拟分别采取合成法和提取法来发现新型结构的活性脂肽。合成法即通过模拟致病菌的脂蛋白TLR2激活活性部位的结构，合理设计并化学合成新型非天然脂肽；提取法即从致病菌培养液中提取、分离和鉴定新型天然细菌脂肽。对于以上两种方法获得的脂肽分子，体外评价其TLR2激活活性和安全性，并作构效关系分析，阐明影响脂肽活性的主要结构因素。对于TLR2激活活性和安全性兼优的脂肽，进一步考察其对模式抗原卵清蛋白的体内佐剂作用，分析免疫应答特点，并评价其对幽门螺杆菌疫苗的粘膜佐剂作用，以期获得免疫应答全面、佐剂活性强的新型脂肽，为疫苗佐剂提供新型候选分子。

本项目完成了148条新型脂肽分子的化学合成。通过TLR2体外激活活性测试，筛选到5条合成脂肽的活性要优于Pam2CSK4（现有文献报道最强的TLR2激动剂），并且具有较好的体外安全性。通过构效关系分析，基本阐释了脂肽的肽段序列与TLR2激动活性之间的关系，为脂肽的合理设计提供了理论依据。本研究中筛选到的5条合成脂肽在体外可以显著诱导BMDCs的成熟，并且提高促炎因子以及Th极化因子的表达，具有很好的疫苗佐剂潜力。此外，合理设计的脂肽LP1和LP2与幽门螺杆菌保护性抗原HpaA联用后免疫小鼠，可以显著降低LP2滴鼻组小鼠胃内幽门螺杆菌的定植量，发挥了显著的粘膜佐剂作用。从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和变形链球菌等重要致病菌的培养上清中提取了6种天然细菌脂肽。将提取的天然细菌脂肽与模式抗原OVA联用，通过肌注或滴鼻免疫小鼠，发现天然细菌脂肽可以显著提高OVA特异性体液以及细胞免疫应答，并可以影响和调节免疫应答类型，说明天然细菌脂肽也具有良好的疫苗佐剂活性。本研究中合成以及提取的新型脂肽为疫苗佐剂提供了新型候选分子。