光基因调控下的膜生理特性改变抑制ESC自我更新及促进神经分化机制的研究

Stem cell transplantation is a promising therapy for neural injury and degeneration disease, however, low cell survival, low differentiation and intergation rate hindered the application in clinic. Many groups have tried to explore new way to enhance survival and differentiation of transplanted cells. Interestingly, the electrical stimulation could reach this end by changing the membrane property of stem cell, while the mechanism is not clarified because of low cellular specific of the electrical stimulation. Optogenetics is widely used, owing to its high temporal and spatial precise. We want to clarify the mechanism for the optical stimulation inhibiting self-renewal of embryonic stem cells (ESCs), inducing neural differentiation. Finally, we want to demonstrate whether optical stimulation could enhance functional recovery of neural injuried mouse transplanted with stem cells.

干细胞移植是神经损伤及变性疾病最具有前景的治疗手段之一，然而移植细胞的存活及分化整合率低制约了临床应用，亟待解决该问题。电刺激可干预干细胞行为，加速损伤组织修复，然而由于电刺激特异性差，具体机制未阐明。提示操控移植入体内的干细胞膜电生理特性为提升干细胞存活及提高临床疗效提供一个重要思路。光遗传学技术具有精准的时空分辨率，我们前期发现光刺激影响了神经干细胞和ESCs的增殖及自我更新，但具体机制尚需探索。本课题拟研究光刺激引发的膜生理特性改变对光基因化胚胎干细胞的自我更新及神经元定向分化的影响，探讨光刺激后胞内ERK信号通路和钙信号通路的活性改变在上述过程中发挥的作用；并初步在体运用光刺激移植入体内的光基因化干细胞，检测是否促进移植细胞的存活、分化及整合，提升治疗效果。该研究旨在阐明调控胚胎干细胞自我更新及定向分化的分子机制，为提高干细胞的临床疗效及推进干细胞治疗临床应用提供新的实验依据。

背景：干细胞移植是神经损伤及变性疾病最具有前景的治疗手段之一，然而移植细胞的存活及分化整合率低制约了临床应用，亟待解决该问题。电刺激可干预干细胞行为，加速损伤组织修复，然而由于电刺激特异性差，具体机制未阐明。提示操控移植入体内的干细胞膜电生理特性为提升干细胞存活及提高临床疗效提供一个重要思路。光遗传学技术具有精准的时空分辨率。本研究运用光遗传学技术改变小鼠胚胎干细胞膜生理特性，通过体内外实验评价对其自我更新、分化的影响。.研究内容：光刺激明显抑制ChR2-GFP-V6.5 mESCs的增殖速度及减少S期比例，同时显著降低维持自我更新的核心转录因子Oct4、Sox2、Nanog、Esrrb及Klf4的表达水平，减少单细胞形成AP阳性克隆的数量；光刺激后引起ChR2-GFP-V6.5 mESCs的胚层特异性相关基因的表达上调，尤其是外胚层相关基因Cdx2、Fgf5及Nestin的表达水平显著升高；光刺激后ERK分子的磷酸化水平显著升高，通过应用ERK通道特异性抑制剂PD0325901可部分缓解光刺激引发的核心转录因子下调。光刺激后下调ChR2-GFP-V6.5 mESCs克隆内细胞之间缝隙连接蛋白Cx43表达水平。GABA可通过上调细胞周期抑制相关因子p21、p27的表达，显著抑制小鼠视网膜干细胞的增殖及自我更新。.意义：通过体外操控胚胎干细胞膜生理特性，可有效提升神经元的分化效率。我们还发现视网膜色素变性后的微环境对于移植后的细胞存活发挥关键作用，这也是制约干细胞替代疗法治疗视网膜变性疾病的一个重要瓶颈问题。课题组下一步拟研究变性视网膜微环境如何抑制移植细胞发挥替代作用，并提出细胞移植前一系列改善微环境的措施，为改进视网膜变性疾病的干细胞治疗提出新的理论依据。