丁酸梭菌与仔猪结肠粘膜上皮细胞互作分子机制的研究

本课题运用荧光定量PCR及Western-blotting技术研究丁酸梭菌与仔猪结肠粘膜上皮细胞模式识别受体（包括TLRs和NODs）的作用，探究丁酸梭菌对仔猪结肠上皮细胞中NF-κB炎症信号通路IKK、IL-2、IL-8、TNF-α及炎症抑制因子IL-10、PPARs、Hsp等相关基因表达的影响，从而初步明确丁酸梭菌与结肠上皮细胞互作的分子机制。本课题运用Western-blotting、荧光免疫技术，研究丁酸梭菌对致病性大肠杆菌所致的结肠粘膜上皮细胞死亡与细胞骨架F-actin裂解的抑制作用，探索丁酸梭菌与结肠粘膜上皮细胞表面integrin β1、E Cadherin的互作机制，从而确定丁酸梭菌抑制有害菌侵袭定植的分子机制。这对揭示丁酸梭菌与结肠粘膜上皮细胞互作及其抑制肠道有害菌定植、侵袭的分子机制具有重要意义，为益生菌在动物生产中的应用奠定理论基础。

试验一：研究了丁酸梭菌对跨膜受体TLRs和炎性因子表达水平的影响。结果显示，丁酸梭菌能够显著提高TLR2 mRNA的表达水平，但不影响TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、MyD88的表达；NF-κB、IL-8、TNF-α的表达量亦显著提高，说明HT-29细胞被诱导发生了免疫反应。与大肠杆菌相比，丁酸梭菌诱导的NF-κB、IL-8、TNF-α的表达水平却低很多。另外，丁酸梭菌能够显著提高IL-10和Hsp70的表达量，这可能和丁酸梭菌的益生特性有关。. 试验二：本试验用siRNA敲除TLR2和MyD88基因。沉默MyD88基因对丁酸梭菌诱导的NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表达没有影响，但是沉默TLR2基因会导致NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表达下降，说明TLR2是丁酸梭菌的特异性受体。因此，丁酸梭菌可激活由TLR2介导的MyD88-非依赖性信号传导通路。. 试验三：用IL-10特异性siRNA和IL-10抗体处理细胞，用以敲除或中和IL-10。结果显示，中和或敲除IL-10促进丁酸梭菌诱导的NF-κB的活化和IL-8的表达。另外发现IL-10被中和后，丁酸梭菌能够诱导HT-29细胞发生严重的凋亡和坏死。结果说明，IL-10在肠道寄主细胞识别丁酸梭菌及丁酸梭菌调节的免疫保护中发挥着重要作用。. 试验四：首先，测定丁酸梭菌和其SCS对EPEC（致病大肠杆菌）的生长、粘附的抑制作用；结果显示，丁酸梭菌和其SCS有显著抑制效果。另一方面，丁酸梭菌和其SCS能够抑制EPEC引发的道细胞凋亡。同时发现，丁酸梭菌可通过调节XIAP、BclXL、FAS、Bcl2、BAX、P53的表达和抑制caspase-9、caspase-3的活力缓解EPEC诱导的细胞凋亡。结果表明，丁酸梭菌既可直接的抑制EPEC的活力，又可间接通过调节凋亡因子的表达抑制EPEC诱导的细胞凋亡，从而发挥对EPEC诱导的肠道炎症的抑制作用。本研究初步揭示了丁酸梭菌的粘附定植机制与免疫调节机理，阐明了其发挥益生作用的机理。. 试验五：动物实验表明，丁酸梭菌能够抑制EPEC诱导的仔猪肠粘膜上皮细胞NF-κB、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子表达，刺激炎症抑制因子IL-10的表达，抑制EPEC刺激的炎症反应，从而发挥免疫调节作用。