丁酸梭菌与猪肠粘膜细胞互作过程中磷壁酸的作用解析及其受体鉴定

In this study, the roles of teichoic acid will be investigated during Clostridium butyricum adhesion,colonization and immune regulation. The receptors of teichoic acid also will be identified. The tagO gene of Clostridium butyricum will be knockd out by homologous recombination technique, the tagO mutant deficient in teichoic acid will be constructed and then fluorescence labeling technique will be used to study the function of teichoic acid during Clostridium butyricum adhesion and colonization. The receptors of teichoic acid will be screened with bioinformatics methods and then the receptors will be identified by Site-directed Mutagenesis and Enhanced Green Fluorescent Portein (EGFP) Labeling techniques, which will provide new clues for understanding the mechanism of Clostridium butyricum adhesion and colonization. ELISA,western-blotting, real time PCR and RNAi will be applied to study the effects of teichoic acid from Clostridium butyricum on the NF-κB and ERK signaling pathways, which will supply a new idea for revealing the immune stimulation mechanisms of probiotics and pathogenic bacteria. This study will provide technical and theoretical basis for the research and development of probiotics in animal nutrition.

本项目以丁酸梭菌为模型，探究磷壁酸在菌体粘附、定植及免疫调节中的作用，并鉴定其受体蛋白。采用基因同源重组技术敲除磷壁酸合成关键酶tagO基因，获得磷壁酸合成缺陷突变体△tagO，进而以荧光标记技术研究磷壁酸在丁酸梭菌粘附、定植过程中的作用；以生物信息学方法模拟筛选猪肠粘膜细胞膜上的磷壁酸受体，运用基因定点突变和绿色荧光蛋白标记技术，鉴定猪肠粘膜细胞膜上与磷壁酸互作的受体蛋白，从而为阐明丁酸梭菌粘附、定植的分子机制提供新线索。综合运用ELISA、Western-blotting、Real time PCR和RNAi技术，通过对猪肠粘膜细胞NF-kB和ERK信号通路的研究，探究磷壁酸在丁酸梭菌免疫调节过程中的作用，并阐明其分子机制，为揭示肠道益生菌和致病菌的免疫刺激机制提供新思路，进而为益生菌在动物营养领域的开发、利用提供技术基础和理论依据。

本研究利用疏水层析、离子交换层析等技术，分离纯化了丁酸梭菌脂磷壁酸，并利用磷钼酸比色、核磁共振、红外光谱等方法，对所得丁酸梭菌脂磷壁酸进行了结构表征。利用ClosTron建立了丁酸梭菌的基因敲除方法。利用氨基荧光微球标记技术，对脂磷壁酸进行了荧光标记，并利用荧光微球标记的脂磷壁酸进行了粘附实验，荧光显微镜观察结果证明了脂磷壁酸是丁酸梭菌重要粘附分子，其识别的细胞膜受体为TLR2。利用荧光定量PCR、Western Blotting、ELISA和荧光素酶报告技术，证明金黄色葡萄球菌脂磷壁酸能够激活NF-κB和ERK1/2信号通路，刺激细胞表达和分泌IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等炎症因子，引起细胞炎症反应，而丁酸梭菌脂磷壁酸能够阻止金黄色葡萄球菌脂磷壁酸的炎症刺激作用。利用MTT法、Hoechst 33342、 Propidium Iodide（PI）双染色法结合流式细胞仪分析，证明了金黄色葡萄球菌脂磷壁酸能够诱导肠粘膜上皮细胞凋亡，而丁酸梭菌脂磷壁酸能够抑制其作用，保护细胞的正常功能。动物试验结果表明，金黄色葡萄球菌脂磷壁酸能够刺激肠粘膜上皮产生和分泌IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α等炎症因子，而丁酸梭菌脂磷壁酸则不会刺激宿主肠道发生严重的炎症反应；利用扫描电镜进行的观察表明，金黄色葡萄球菌脂磷壁酸能够引起仔猪肠粘膜上皮损伤，微绒毛致密程度下降，而丁酸梭菌脂磷壁酸则不会导致这种现象发生，并能够抑制金黄色葡萄球菌脂磷壁酸引起的损伤，这提示脂磷壁酸是丁酸梭菌重要的功能成分，在其免疫调节中发挥重要作用。