丁酸梭菌对仔猪大肠杆菌性腹泻的干预机制研究

It is well known that Enterotoxigenic Escherichia coli-induced diarrhea is a severe challenge in pig industry, which has caused great loss to economy. Our previous research works have confirmed that Clostridium butyricum (CB) can relieve Escherichia coli-induced diarrhea in broilers and piglets. This project aims to study the effects of CB on the growth, adhesion, production of enterotoxin in Escherichia coli, and regulation of factors associated with diarrhea and inflammation in porcine intestinal epithelial cells and intestine challenged with Escherichia coli, and analyze intestinal microflora in pigs. Metabolomes of serum, intestinal mucosa and intestinal microflora are measured by GC-MS and LC-MS. Furthermore, a novel research strategy is proposed. The mucosal metabolomes, microbial profile, and metabolic metabolomes of gut microbiota are combined by multivariate statistical methods in order to clarify the interactions of host-gut microbiota. Therefore, we elucidate the mechanism that CB relieves Escherichia coli-induced diarrhea in piglets from the aspects of physiological activity in Enterotoxigenic Escherichia coli,intestinal structure and function, and gut mirobiota and its metablic activity in. This project can provide important theoretical basis for probiotics application and research, and also offer reference information for animal nutrition.

仔猪大肠杆菌性腹泻是养猪业面临的严峻挑战，带来巨大的经济损失。我们实验室的前期研究表明丁酸梭菌可以减缓由产肠毒素大肠杆菌引起的肉鸡下痢和仔猪腹泻，本项目拟在此基础上研究丁酸梭菌对大肠杆菌的生长、粘附抑制和肠毒素产生的影响，以及对大肠杆菌刺激仔猪肠道上皮细胞和肠道组织中与腹泻、炎症相关因子的调控作用，并分析仔猪肠道菌群结构。同时运用基于GC-MS和LC-MS的代谢组学方法，研究丁酸梭菌对大肠杆菌感染仔猪肠道黏膜代谢组和肠道菌群代谢谱的影响。并进一步采用新的研究策略，运用多变量统计分析将仔猪肠道黏膜代谢组、肠道菌群代谢谱、肠道菌群结构相关联，进行共变异分析，阐明肠道微生物与肠道间的相互作用关系。从大肠杆菌的生理活动、肠道结构和生理功能、肠道菌群及其代谢活性角度阐明丁酸梭菌减缓仔猪大肠杆菌性腹泻的作用机制，以期为益生菌的研究运用提供重要的理论基础，也为动物营养与病理研究提供参考。

仔猪大肠杆菌性腹泻是养猪业面临的严峻挑战，带来巨大的经济损失。我们实验室的前期研究表明丁酸梭菌（Clostridium butyrium, CB）可以减缓由产肠毒素大肠杆菌（Entertoxigenic Escherichia coli, ETEC）引起的肉鸡下痢和仔猪腹泻。本项目拟在此基础上通过体外细胞实验模型，阐明了丁酸梭菌对 ETEC 粘附抑制作用和肠毒素产生的影响。通过饲料中添加丁酸梭菌的仔猪饲养实验，分析仔猪空肠和盲肠的菌群结构和大肠杆菌数量以及炎症反应。结果表明，CB处理组显著抑制了ETEC黏附基因FaeG和产肠毒素基因estA、estB的表达（P＜0.05）。与对照组相比，ETEC处理IPEC-J2后，IPEC-J2促炎因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8表达水平显著升高（P＜0.05），炎症抑制因子IL-10显著降低（P＜0.05）。而添加CB干预后，与ETEC处理组相比，IPEC-J2促炎因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8表达水平显著降低（P＜0.05），炎症抑制因子IL-10显著升高（P＜0.05）。丁酸梭菌脂磷壁酸（BAC-TA）高浓度（0.15mmol/L）短时间（0.5h）和低浓度（0.05mmol/L）长时间（24h）均可降低IPEC-J2细胞TNF-α分泌量，提高IL-10分泌量；同时也提高TLR2 和TLR9基因的表达。此外，BAC-TA阻止LPS诱导的IPEC-J2细胞p65, p38MAPK和 ERK1/2磷酸化。采用特殊的抗体阻断NF-κB, p38MAPK和ERK1/2 信号通路，可降低TNF-α and IL-10的表达，但是阻断TLR4受体对TNF-α 和IL-10表达无影响。日粮添加500和2000g/Kg的丁酸梭菌对断奶仔猪平均日增重、平均日采食量、料肉比和各免疫器官指数并无显著影响（P>0.05）；与对照组相比，日粮添加丁酸梭菌显著降低了断奶仔猪的料肉比和腹泻率（P<0.05），死淘率也有降低的趋势。仔猪空肠中厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、广古菌门（Euryachaeota）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，其中各组的厚壁菌门的相对丰度都在75%左右。在属的水平上，对照组中埃希氏菌属（Esche