基于扫描电化学显微镜与微流控技术的单个肿瘤细胞无标记成像与基因表达分析研究

Current approaches for single cell analysis have been hindered by fluorescent labelling. Conventional flow cytometry, high content microscopy are incapable of analysing single cell images and corresponding gene expression relationship. Therefore, developing new techniques that allows label-free imaging and gene expression analysis of individual cells are of great importance. Such a novel method could provide a new way to singl-cell label-free analysis and enables new strategy to depict single cell heterogenesis. Due to some special designs, such as micro pits array, microfluidics can be used to effectively control and sort out single tumor cells. Combined with the SECM label-free imaging strategy, downstream multigene expression analysis of single living cells can be performed by respectively selecting individual cell interested to achieve accurate sampling and integration analysis of tumor cells at the single cell level. This is not only a direct and advanced application of scanning electrochemical microscopy and microfluidic chip technology, but also a useful complement and direct creativity to the research of tumor cell biology.

当前的单细胞分析技术局限于荧光分子标记等标记技术，并且流式细胞仪、高内涵显微镜等方法无法对指定单细胞的图像和基因表达之间的对应关系进行高通量分析。因此，当前亟待发展能够精确地进行单细胞的无标记成像以及分析与其对应基因表达关系的技术，为单细胞分析提供一种全新的策略和方法。我们认为利用微流控芯片的某些特殊设计，如微坑阵列等微结构可以精确地对单个肿瘤细胞进行有效地控制和分选。结合SECM 无标记成像的策略可以在成像之后分别地挑选感兴趣的单个细胞进行下游的多基因表达分析，从而在单细胞水平上实现对肿瘤细胞的精确采样与集成分析。该项目的顺利实施不仅是对扫描电化学显微镜技术和微流控芯片技术的直接高级应用，而且是对肿瘤细胞生物学研究技术的有益补充和直接创新。

本项目针对单细胞分析技术的无标记成像和基因表达之间的对应关系问题，将扫描电化学显微镜技术和微流控芯片技术相结合，致力于发展和建立能够精确地进行单细胞的无标记成像以及分析与其对应基因表达关系的全新的策略和方法。体外肿瘤三维模型是当前研究肿瘤生物学新的有力工具，能够更好地重构体内的肿瘤形态和生理环境。我们首先利用可打开的微流控芯片技术手段，将肿瘤和体细胞团块的培养集成在一块芯片上（85 x 4培养单元）。芯片开放后利用SECM对不同细胞团块扫描成像，后续精准地挑取单个细胞团块进行多基因表达分析。新方法为今后肿瘤细胞SECM成像研究和下游精准的基因调控分析架构了新的桥梁（Anal. Chem. 2019, 91, 4307–4311）。其后，由于肿瘤在体（动物体）的种种限制，难以对肿瘤的模型进行多种维度上的实时研究，我们利用3D打印设备快速地得到用于生成和培养三维细胞团簇生物学研究的实验装置（Sci. Rep., 2019, 9, 19717）。另外，我们进一步发展了一种利用微流控技术简单地实现肿瘤三维团簇于体细胞三维团簇之间大规模1:1配对的方法。利用不同深度的微井阵列可以对肿瘤和体细胞（成纤维细胞）实现分别培养和精准配对（Anal. Chem. 2020, 92, 7638–7645）。最后，我们利用微流控在空间上对单细胞位置的精准操控，使得SECM克服了传统扫描过程中成像过程慢的局限。20分钟内，对82个单细胞进行了无标记成像分析。开放的芯片架构，为将来下游无缝衔接单细胞RNA测序以及其他的组学分析提供了可能（Anal. Chem. 2021, 93, 12417−12425）。