Munc18b和Munc18c调控GLUT4胞吐的机制研究

Impairment in insulin-stimulated GLUT4 (glucose transporter 4) exocytosis is a hallmark of insulin resistance and type 2 diabetes. GLUT4 vesicle fusion is mediated by SNAREs and Sec1/Munc18 (SM) proteins. While Munc18c is clearly a key SM protein in GLUT4 vesicle fusion, its mild loss-of-function phenotype cannot explain the essential role of SM proteins in vesicle fusion, which also make it difficult to study its regulatory mechanisms in adipocytes and mice. We have recently found that Munc18c promotes GLUT4 vesicle fusion by accelerating trans-SNARE zippering in the fusion reaction. In our preliminary studies, we further solved the key puzzle in the field by demonstrating that both Munc18b and Munc18c are the cognate SM proteins in GLUT4 exocytosis. We hypothesize that Munc18b and Munc18c play the same function in GLUT4 exocytosis by promoting the SNARE mediated vesicle fusion. In this proposal, we will take advantage of the CRISPR/Cas9 genome editing and our unique functional reconstitution assay to investigate the regulatory mechanisms of Munc18b and Munc18c in GLUT4 exocytosis. This work will help to understand the molecular basis of insulin resistance and identify new drug targets from the regulation of GLUT4 exocytosis.

胰岛素刺激GLUT4（葡萄糖转运蛋白4）胞吐受损是胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要特征。GLUT4胞吐膜融合需要通过SNARE和SM蛋白来调控。Munc18c是参与GLUT4胞吐的SM蛋白，但是在细胞和小鼠中其功能丧失却只有微弱的表型。这与SM蛋白在胞吐膜融合中的关键作用明显不符，也为从体内研究Munc18c的调控机制增添了难度。我们首次证明了Munc18c具有通过加快SNARE复合物组装来促进GLUT4膜融合的正调控功能，并且在预实验中发现另一个SM蛋白Munc18b也参与了调控。我们推测Munc18b与Munc18c在GLUT4胞吐中功能一致，都能通过与SNARE作用促进膜融合。本课题拟通过脂肪细胞基因编辑和膜蛋白功能重组技术，在细胞和分子两个层次上深入研究Munc18b和Munc18c在GLUT4胞吐中的调控机制，为认识胰岛素抵抗的产生机制和以GLUT4胞吐为靶治疗胰岛素抵抗提供新思路。

在脂肪、骨骼肌等胰岛素响应组织中，胰岛素通过调控葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）转运来维持血糖平衡。GLUT4转运障碍是胰岛素抵抗和2型糖尿病的一个主要病理特征。GLUT4储存囊泡与细胞质膜融合是GLUT4转运的关键步骤。SNARE复合物及其调控因子Sec1/Munc18(SM)蛋白是介导GLUT4胞吐膜融合的核心蛋白质机器。我们发现当脂肪细胞Munc18c缺失时，另一种SM蛋白Munc18b可以通过功能代偿参与调控GLUT4胞吐，这解释了前期研究中发现的Munc18c功能丧失不能显著抑制胰岛素刺激GLUT4胞吐的问题。与Munc18c不同，Munc18b识别的SNARE复合物体系不是传统认为介导GLUT4胞吐的Syntaxin-4/SNAP23/VAMP2。我们利用体外重构等方法发现Munc18b可以促进Syntaxin-2介导的膜融合反应，表明Munc18b与Munc18c在GLUT4胞吐中的保守功能是与SNARE协同作用促进囊泡融合。我们进一步探讨了SM蛋白通过与SNARE复合物作用调控GLUT4胞吐的分子机制，发现SM蛋白通过其3a结构域上保守的SNARE类似肽（SLP）促进GLUT4胞吐SNARE复合物介导的膜融合。机制研究表明SM蛋白通过结合并激活t-SNARE来促进SNARE复合物的形成。另外，我们还发现SNARE组装的空间约束可能是GLUT4胞吐膜融合过程中SNARE复合物形成的关键限速因素，SM蛋白通过释放SNARE复合物组装过程中的空间约束来加快膜融合反应速率。这些研究结果揭示了SM蛋白家族在GLUT4胞吐中的调控机制，为深入理解细胞内囊泡融合的机理奠定了基础。我们的发现为认识胰岛素抵抗的产生机制和以GLUT4胞吐为靶治疗2型糖尿病提供了新思路。