Extended Synaptotagmins在内质网与细胞质膜互作中的机制研究

The extended synaptotagmins (E-Syts) are key proteins involved in the endoplasmic reticulum-plasma membrane interactions. They tether the opposed membranes to form membrane contact sites. We have recently found that the cytosolic domain of E-Syt1 transfers glycerophospholipids between membrane bilayers in the presence of Ca2+. However, it’s still not known if E-Syt2 and E-Syt3 could mediate lipid transfer. In our preliminary studies, we successfully reconstituted the full-length E-Syt1 into the liposomes, and demonstrated that this reconstituted E-Syt1 could transfer lipid in a Ca2+ dependent manner. Unexpectedly, we discovered that both Ca2+-independent and Ca2+-dependent lipid transfer were mediated by E-Syt2. We hypothesize that E-Syt1 tethers the membranes through its C2C domain binding to Ca2+ and PI(4,5)P2, and uses its Ca2+ -bound C2A domain to further regulate lipid transport. We also hypothesize that E-Syt2 and E-Syt3 maintain the membrane contact sites and spontaneous lipid transfer through the C2C domain, while stimulate the lipid transfer by C2A in the presence of Ca2+. In this proposal, we will take advantage of our unique functional reconstitution and the microsomal vesicles based assay to disclose the function and molecular mechanisms of E-Syts in the endoplasmic reticulum- plasma membrane contact sites.

Extended Synaptotagmins (E-Syts)是一类参与内质网-细胞质膜互作建立和维持的关键分子。我们在前期工作中发现E-Syt1的胞质域部分能够在钙离子的调控下转移磷脂，但E-Syt2和E-Syt3能否转移脂质还不清楚。在预实验中，我们成功地将全长E-Syt1重组到膜上并观察到了钙离子依赖的脂转移活性，同时还发现E-Syt2能够介导非钙离子依赖和钙离子依赖两种途径的脂转移。我们提出假设“内质网上的E-Syt1通过C2C结合钙离子和PI(4,5)P2来调节接触位点的形成，并通过C2A结合钙离子来调控脂转移；E-Syt2和E-Syt3通过C2C与质膜作用维系接触位点并介导非钙离子依赖的脂转移，通过C2A结合钙离子调控钙离子依赖的脂转移。”本项目将通过膜蛋白功能重组等方法对这一假设进行逐步论证，揭示不同E-Syts在内质网和细胞质膜互作中维持接触位点和转移脂质的分子机制。

真核细胞的内质网与细胞质膜之间形成广泛的膜接触位点，在钙稳态维持、脂代谢等生理过程中发挥重要作用。Extended Synaptotagmin (E-Syt)是一类作用于内质网-细胞质膜接触位点的关键蛋白。我们利用体外重构等方法系统研究了不同E-syt蛋白的功能和作用机制，揭示了膜栓系和脂质转移是这一蛋白家族的保守功能。在哺乳动物细胞中， E-Syt1、E-Syt2和E-Syt3都可以介导钙离子依赖的脂质转移，但是E-Syt1的脂转移能力要明显高于E-Syt2和E-Syt3。与E-Syt1需要C2A和C2C结构域不同，E-Syt2需要C2A结构域来调控钙离子依赖的脂质转移。E-Syt2的C2C结构域与PI(4,5)P2结合只参与维系膜接触位点。E-Syt的酵母同源蛋白Tcb3和植物同源蛋白SYT1都能以非钙离子依赖和钙离子依赖两种方式介导脂质转移。Tcb3通过SMP与磷脂酰丝氨酸（PS）结合介导非钙离子依赖的脂质转移，通过C2C和C2D结构域调控钙离子依赖的脂质转移。SYT1通过C2A结构域与PI(4,5)P2结合促进SMP结构域介导的非钙离子依赖的脂质转移，而钙离子促进的脂质转移则需要C2A结构域同时与PS和PI(4,5)P2作用。我们的研究结果有助于理解E-Syt蛋白参与维持细胞膜完整性和植物抵御非生物胁迫的分子机制。除此之外，我们还发现E-Syt1和E-Syt2结合形成异源复合物，在钙离子的作用下协同调控内质网和质膜之间的脂质转移。这些研究结果揭示了不同E-Syt蛋白在内质网和质膜互作中维系膜接触位点和介导脂质转移的功能和作用机理，对于理解内质网和质膜互作的建立、调控和功能具有重要的科学意义。