丙酮丁醇发酵过程中菌体自溶现象的遗传学基础研究

Understanding the cellular physiology of the ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation at the molecular level is a prerequisite to improving the process efficiency. In the later phase of ABE fermentation, autolysis of Clostridium cells occurres, which leads to the cease of fermentation process, with limited amount of solvent produced. The aim of this proposal is to identify and characterize genes involved in the autolysis of Clostridium acetobutylicum, which is a model bacterium of ABE fermentation, so as the genetic basis of the autolysis phenomenon in ABE fermentation can be demonstrated. Firstly, twelve putative autolysin genes predicted from sequenced genomes will be individually inactivated, with the aim to identify which genes are involved in autolysis. In the meantime, unknown genes involved in autolysis will be identified by screening a genome-scale insertional mutant library of C. acetobutylicum, which will be constructed using mariner transposon technique. Subsequently, the cooperative contribution of different genes to autolysis and the effect of autolysis on other physiological functions will be investigated. The results are expected to elucidate the genetic basis of autolysis in C. acetobutylicum, and will contribute to developing robust solvent producing strains as well as to optimization of fermentation processes.

在分子水平上认识丙酮丁醇发酵（ABE发酵）过程中细胞基本生理变化的本质，是提高ABE发酵效率的基础。在ABE发酵后期，菌体会发生自溶，导致溶剂生产能力迅速丧失，严重限制了溶剂产量的提高。为从遗传学角度认识ABE发酵中菌体自溶现象的本质原因，本项目拟以ABE发酵的模式菌株丙酮丁醇梭菌为对象，首先对预测的12个假定的自溶菌素编码基因进行功能研究，确定这些基因在菌体自溶中的贡献；同时利用mariner转座子随机突变技术在全基因组水平上寻找参与自溶过程的未知基因。在确定了参与菌体自溶基因的基础上，研究这些基因间的协作关系，以及对丙酮丁醇梭菌其它生理功能的影响，从而全面解析ABE发酵过程中自溶现象的遗传学基础，为ABE发酵的过程控制和菌株改造，提供新的理论依据与策略。

本项目以丙酮丁醇溶剂发酵过程中出现的菌体自溶现象为对象，研究了自溶现象的遗传学基础。测定了丙酮丁醇梭菌DSM 1731的全基因组序列并完成了生物信息学分析，预测得到了12个推定的自溶素基因。在丙酮丁醇梭菌DSM 1731中对12个基因分别进行了克隆表达，通过测定胞内自溶活性、生长曲线、活细胞数、细胞形态等参数，对12个基因的过表达菌株进行自溶表型分析，证明了SMB_G3117是一个参与细胞自溶的基因，显著增加了我们对丙酮丁醇发酵发酵过程自溶现象的认识，同时也为理性改善丙酮丁醇梭菌的产溶剂能力提供了新思路。我们还测定了一株只产丁醇不产丙酮的假破伤风梭菌的全基因组序列（基因组序列为APJS01000000），并对该菌株丙酮途径关键酶的活性进行了测定，解析了不偶联丙酮产生的丁醇产生菌的遗传学基础。鉴于产溶剂梭菌遗传操作效率仍不高，为了在梭菌中发展更为高效的基因敲除方法和外源基因的基因组整合方法，我们在梭菌属菌株中筛选获得了有功能的RecET/RecT重组酶，最终在梭菌中首次实现了重组工程操作，将有助于在梭菌中发展更高效的基因编辑方法。本项目研究成果共在应用生物技术主流SCI期刊发表论文7篇，培养博士生2名，硕士生1名。参加项目的3名工作人员，分别从副研究员晋升为项目研究员、从助理研究员晋升为副研究员，以及获得加州大学伯克利分校唐氏学者资助，人才培养效果显著。