甲硫达嗪逆转胃癌赫赛汀耐药的作用和分子机制

Herceptin has been approved for the treatment of advanced gastric cancer with Her2 positive, but the effective rate is only 12%-13%, the related mechanism is rarely reported. Our previous studies showed that excessive activation of STAT3/Notch signaling axis plays an important role in Herceptin resistance of gastric cancer. Then we found that S phase kinase associated protein 2 (Skp2) which is the target protein of Notch showed high expression in Herceptin resistant gastric cancer cells; Thioridazine can down-regulate the expression of Skp2, enhance the sensitivity of Herceptin, and inhibit glucose uptake in resistant gastric cancer cells. To this end, we put forward the hypothesis: Thioridazine can reverse Herceptin resistance of human gastric cancer through inhibite aerobic glycolysis which is mediated by Skp2. We plan to detect the impaction of aerobic glycolysis mediated by Skp2 in Herceptin resistance of gastric cancer by IP, Western-blot;to analyse the of regulation effect of thioridazine on Skp2 and the signal mechanism of it, by using siRNA and specific signal pathway transduction inhibitors; to explorate the candidate dosing strategy of thioridazine with low toxic and high effective by transplanted tumor in mouse models. It may provide a theoretical and experimental basis for the application of thioridazine in the target treatment of gastric cancer and the establishment of a new individualized treatment scheme for gastric cancer in future.

赫赛汀已被批准用于Her2阳性的晚期胃癌治疗，但是有效率仅12%-13%，相关机制鲜有报道。我们的前期研究表明，STAT3/Notch信号轴的过度活化在胃癌赫赛汀耐药中发挥重要作用。随后我们发现，Notch的靶蛋白——S期激酶相关蛋白2（Skp2）在耐药的胃癌细胞中呈高表达；甲硫达嗪可下调Skp2的表达，增强赫赛汀的敏感性，并抑制耐药细胞的葡萄糖摄取。为此，我们提出假说：甲硫达嗪通过抑制Skp2介导的有氧糖酵解，逆转胃癌赫赛汀耐药。拟通过IP、Western-blot等方法，检测Skp2介导的有氧糖酵解在胃癌赫赛汀耐药中的作用；应用siRNA和特异信号通路抑制剂，分析甲硫达嗪对Skp2的调控作用和信号机制；以小鼠移植瘤为模型，探索逆转胃癌赫赛汀耐药的低毒、高效的候选给药策略。通过揭示甲硫达嗪的作用和机制，为甲硫达嗪在胃癌靶向治疗中的应用及胃癌未来新型个性化治疗方案的建立提供理论和实验依据。

本课题以赫赛汀诱导耐药的HER2阳性胃癌细胞HGC27-R和SGC7901-R为实验模型，通过基因沉默、基因过表达和Pull-down等技术围绕Skp2及其上下游信号通路深入靶向研究甲硫哒嗪增敏赫赛汀抑瘤作用的效果、机制和给药策略。实验结果：（1）Skp2高表达与胃癌赫赛汀治疗耐药正相关。甲硫达嗪可以抑制EGF诱导的Skp2表达和Akt/m-TOR信号活化，抑制HGC27-R和SGC7901-R细胞的增殖、细胞凋亡抵抗、葡萄糖摄取和乳酸生成；（2）不同浓度的甲硫哒嗪与赫赛汀配比，可以增强赫赛汀对耐药细胞的增殖抑制作用，诱导细胞凋亡，增强对糖酵解的抑制作用，对小鼠移植瘤的生长具有一定的抑制作用。甲硫哒嗪与拉帕替尼联用在体内外具有更强的协同抑瘤作用，更显著地诱导细胞凋亡和抑制糖酵解，显著抑制SGC7901-R细胞小鼠移植瘤的生长，是赫赛汀耐药的HER2阳性胃癌患者的潜在给药方案；（3）甲硫哒嗪是多靶点抑制剂，还可以抑制STAT3/PFKFB3和HSF1/LDHA的活化和表达。在肿瘤耐药细胞中存在IL-8等炎症细胞因子的自分泌，引起STAT3和HSF1信号的串话，促进耐药和肿瘤干细胞表型的维持。联合靶向HSF1 和STAT3具有协同抗癌作用，是一种潜在的肿瘤治疗策略；（4）设计和合成的一些小分子化合物可以显著抑制STAT3的酪氨酸705位磷酸化、入核、二聚体形成、转录激活和下游靶基因的表达，可以显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、凋亡抵抗、迁移和侵袭，显著抑制小鼠移植瘤的生长和扩散，具有开发为STAT3靶向研究工具和乳腺癌治疗药物的潜力；（5）TCGA、GEO数据库和肿瘤临床标本免疫组化的分析结果显示，甲硫哒嗪的受体DRD4在肿瘤组织中较癌旁组织表达升高，并与肿瘤的耐药、干细胞转化和血管生成等恶性表型密切相关。DRD4的高表达可以激活PI3K/Akt信号，增强β-catenin的蛋白稳定性和入核，启动肿瘤干细胞标记物的转录表达。通过sgRNA敲除DRD4表达或应用DRD4的选择性阻断剂L745870，可以下调肿瘤细胞中P-gp,CD24和CD133等的表达，减少耐药细胞的微球形成，降低细胞在裸鼠体内的致瘤性。靶向DRD4可能是潜在的逆转肿瘤耐药的新策略。