miRNA在凤丹耐铜适应性中的调控机理及表达特征

凤丹为安徽铜陵凤凰山特有的药用牡丹种类，也是观赏牡丹嫁接繁殖的优良砧木，具有很高的经济价值。我们的研究发现其具较强的耐铜性，具修复土壤铜污染潜力，具重要的生态价值。microRNA是新发现的基因表达调控因子，在植物对多种逆境胁迫（包括重金属胁迫）的适应性中发挥重要作用。本研究主要采用克隆与生物信息学相结合的方法，构建铜胁迫下凤丹的miRNA cDNA文库、克隆测序，获得相关的miRNA，并预测其靶基因；确定凤丹耐铜相关的miRNAs，并进行初步的生物功能验证；同时用Q-RT-PCR分析miRNAs的时空表达特征。本研究可拓宽对凤丹响应铜的转录后调控分子机制的认识，丰富其耐铜适应性的理论，为将凤丹应用于铜污染土壤的修复提供科学依据，同时为培育高抗低积累铜的凤丹品种提供新的分子育种技术手段和基础育种材料，为中药材的安全生产提供技术保障，具有重要的现实意义。

本项目按照计划书要求完成了研究内容。增加了凤丹响应铜胁迫的转录组分析。 本项目以安徽铜陵的凤丹种子为材料，通过培育实生幼苗进行铜胁迫处理水培试验，分不同时间取样，分别提取根、茎、叶中的总RNA，一方面构建了对照和铜胁迫两个转录组文库并进行高通量测序，得到了大量转录水平上差异表达的基因信息，并筛选了与铜胁迫响应机理相关的重要基因的差异表达进行了q-RT-PCR验证，证实了测序结果的可靠性；另一方面，构建了和两个miRNA文库并进行高通量测序，在两个文库中一共发现102条保守miRNA以及凤丹特有的34条新miRNA，并结合转录组信息对64个已鉴定的凤丹保守miRNA和27个新miRNA的靶基因进行了预测；鉴定出响应铜胁迫表达量上升的miRNA59条，表达量下降的74条，其中12条保守的和18条新miRNA发生显著的差异；采用qRT-PCR验证了9条响应铜胁迫的miRNA（>5倍）的表达情况，证实与高通量测序结果大体相符。同时，利用转录组数据，验证了16条对应的靶基因的表达。miRNA的表达和它们的候选靶基因的表达水平基本呈现负相关趋势。进一步采用qRT-PCR法验证了6个miRNA和及其对应的5个靶基因的时空表达差异性。