油茶皂苷上调AE3表达及其通过AE3调控缺血/再灌注心肌细胞内Cl-外流与线粒体保护机制研究

Anion exchanger 3 (AE3), a member of the Solute Carrier 4 (SLC4) protein family, mediates the reversible electroneutral exchange of Cl- for HCO3- across the plasma membrane and exerts a central role in the regulation of intracellular Cl- concentration, intracellular pH, and cardiovascular homeostasis. Our previous work shown that Sasanquasaponin (SQS) can inhibit ischemia/reperfusion-induced elevation of intracellular Cl- concentration ([Cl-]i) followed by the attenuation of Ca2+ overload, ROS production, and cell apoptosis by up-regulating AE3 protein expression. In the present study, by using a variety of signal pathway inhibitor and molecular biology methods, we will futher analyse the regulatory mechanisms by which SQS up-regulates AE3 expression and increases Cl-/HCO3- exchange activity of AE3 protein from NO/PKCε/Ras/ERK1/2 signaling pathway and phosphorylation level of serine 67 of AE3 protein at the cellular and whole-animal levels. Moreover, this study will further explore novel targets and mechanisms of AE3-mediated SQS cardioprotection from aspect of mPTP opening and chloridion transport. This study will provide new experimental and theoretical basis for further developing SQS.

阴离子交换蛋白3（anion exchanger 3, AE3）属于SLC4蛋白家族，具有可逆性电中性Cl-/HCO3-交换活性，在调节细胞内Cl-的浓度等方面起着重要作用。最近，我们在前一基金资助下证实，SQS预处理能上调AE3蛋白的表达，并通过AE3蛋白促使缺血/再灌注（I/R）心肌细胞内过载的Cl-外排，对抗I/R所诱发的氧化应激、钙超载和细胞凋亡。在此工作基础上，本研究拟在细胞和整体水平，借助信号通路抑制剂，利用一系列分子生物学实验手段，从NO/PKCε/Ras/ERK1/2信号通路的变化以及AE3蛋白Ser67位点磷酸化程度改变的角度，进一步阐明SQS对AE3蛋白表达及其促Cl-/HCO3-反向交换的调控机制；同时，从细胞内Cl-动态变化及mPTP功能改变入手深入全面地揭示SQS通过AE3蛋白发挥心肌保护效应的新靶点和新机制。该研究的完成将为进一步研发SQS提供新的理论和实验依据

油茶皂苷（Sasanquasaponin, SQS）是从油茶籽中提取出来的一种有效单体成分。阴离子交换蛋白3（anion exchanger 3, AE3）属于SLC4蛋白家族，具有可逆性电中性Cl-/HCO3-交换活性，在调节细胞内Cl-的浓度等方面起着重要作用。我们前期工作证实，SQS预处理能上调AE3蛋白的表达，并增强AE3蛋白的Cl-/HCO3-反向交换活性，进而促使缺血/再灌注（I/R）心肌细胞内过载的Cl-外排，对抗I/R所诱发的氧化应激、钙超载和细胞凋亡。然而，SQS上述效应的分子机制尚未完全阐明。在本研究，我们在细胞和整体水平，借助NO清除剂c-PTIO、PKCε特异性抑制剂ϵV1-2、Ras抑制剂FTS以及ERK1/2抑制剂U0126，证实SQS预处理上调心肌细胞内AE3蛋白表达的分子机制涉及NO/PKCε/Ras/ERK1/2信号通路的激活；另外，利用PKCε特异性抑制剂ϵV1-2及激活剂DCP-LA，同时结合AE3-shRNA慢病毒表达载体、野生型AE3及S67A突变型AE3重组腺病毒表达载体转染等的一系列分子生物学实验手段，我们证实SQS预处理增强I/R心肌细胞内AE3蛋白的Cl-/HCO3-反向交换活性的分子调控机制与其激活PKCε，进而促使AE3蛋白67位点Ser磷酸化有关；此外，利用mPTP抑制剂cyclosporin A、mPTP开放剂atractyloside以及细胞外液Cl--free模型，我们进一步证实SQS通过AE3蛋白抑制I/R所诱发的氯过载后，对抗I/R所诱发的Ca2+超载、细胞凋亡及氧化应激的分子机制与其抑制mPTP开放，稳定线粒体膜电位，保护线粒体功能有关。本研究不仅丰富了AE3蛋白介导SQS心肌保护的分子机制研究，而且为进一步研发SQS提供了理论和实验依据；同时，本研究也对进一步开发利用地区资源油茶籽具有一定的科学意义和实用价值。本课题全面完成研究计划，发表SCI论文4篇，并完整培养了硕士研究生2名。