基于DJ-1-Grp75-线粒体复合体Ⅰ调控途径探讨DJ-1介导心肌缺血预适应延迟保护的新机制

DJ-1 is a recently identified cellular protein which is ubiquitously expressed in multiple tissues throughout the body and has a significant role in anti-oxidative stress. Our previous work shown that DJ-1 mediates the delayed cardioprotection of ischemic preconditioning (IPC) against ischemia/reperfusion (I/R) injury at least partially through activation of the Nrf2-ARE pathway. However, the DJ-1-mediated cardioprotection is difficult to be fully explained by only activation of Nrf2-ARE pathway. Obviously, it has important theoretical significance and application value to find the other mechanisms and targets of DJ-1-mediated delayed cardioprotection of IPC. Therefore, in the present study, by using a variety of molecular biology methods, we will further explore the novel targets and mechanisms of DJ-1-mediated IPC delayed cardioprotection from the perspective of DJ-1 mitochondrial translocation and modulation of mitochondrial complex I activity at the cellular and whole-animal levels. This study will provide new strategies for prevention and treatment of acute myocardial injury.

DJ-1是最近报道的一种在体内广泛分布、高度保守的具有显著抗氧化应激作用的胞内蛋白。在前一基金资助下我们证实，DJ-1作为内源性保护蛋白参与了心肌缺血预适应（IPC）的延迟保护，其机制与Nrf2-ARE抗氧化通路有关。但DJ-1的心肌保护效应难于完全用Nrf2-ARE通路的激活来解释。显然，寻找DJ-1介导心肌IPC延迟保护的其它机制和靶点具有十分重要的理论意义和应用价值。为此，本研究拟在细胞和整体水平，利用一系列分子生物学实验手段，从DJ-1线粒体内膜亚定位及呼吸链复合体Ⅰ酶活性调节的角度，探讨DJ-1介导心肌IPC延迟保护的新机制，寻找其心肌保护作用的新途径和新靶点，并进一步阐明这一重要的内源性细胞保护物质的生理与病理意义，为缺血性心肌损伤的防治提供新思路和新的干预环节。

DJ-1作为细胞内重要的抗氧化应激蛋白近来被报道在调控线粒体复合体I活性，维持线粒体功能稳定方面起着至关重要的作用。我们前期工作证实DJ-1是心肌细胞内重要的内源性保护蛋白，并参与了心肌缺血预适应（IPC）延迟保护。然而，其介导心肌IPC延迟保护的分子机制尚未完全阐明。在本研究，我们将DJ-1/Grp75/复合体I/线粒体活性氧（mtROS）有机结合，在细胞和整体水平，借助基因转染及RNA干扰等分子生物学手段，进一步探讨了DJ-1介导心肌IPC延迟保护的分子机制。结果发现：心肌IPC能显著上调DJ-1表达并促其线粒体亚定位；同时，显著增加缺血/再灌注（I/R）心肌细胞内复合体I的酶活性，维持线粒体膜电位稳定，抑制mtROS产生，对抗I/R所诱发的氧化应激，产生延迟保护。重要的是，一方面，心肌IPC上述效应在DJ-1沉默的心肌细胞中被逆转，而被外源性上调DJ-1表达的心肌细胞所重现。另一方面，DJ-1介导的IPC增加I/R心肌细胞内复合体I酶活性、抑制mtROS产生、对抗I/R氧化应激损伤的延迟保护作用均可被复合体I抑制剂Rotenone所抑制。此外，我们进一步发现，心肌IPC能促进DJ-1与Grp75蛋白相互作用，DJ-1线粒体移位后，进一步促进DJ-1与复合体I亚基ND1和NDUFA4的相互作用。有趣的是，沉默DJ-1或Grp75，抑制DJ-1与Grp75相互作用后，心肌IPC促DJ-1线粒体亚定位效应被抑制；另外，沉默DJ-1、ND1或NDUFA4，抑制DJ-1与ND1和NDUFA4亚基相互作用后，DJ-1介导IPC保护复合体I酶活性的效应被抑制。上述结果表明，DJ-1介导心肌IPC延迟保护的分子机制与其保护线粒体复合体I活性，维持线粒体功能稳定，抑制mtROS产生有关。此外，结果表明在DJ-1介导心肌IPC延迟保护过程中，缺乏线粒体靶向序列的DJ-1需通过与Grp75伴侣蛋白结合，在Grp75“分子向导”协助下，完成在线粒体内膜上的亚定位，随后通过与ND1和NDUFA4亚基相互作用，进而维持线粒体复合体I的酶活性。本研究不仅丰富了DJ-1蛋白介导心肌IPC延迟保护的分子机制研究，而且为缺血性心肌损伤的防治提供新思路和新的干预环节。. 本课题全面完成研究计划，发表学术论文7篇（标注资助），并完整培养硕士研究生3名。