DEPDC5基因突变调控mTOR信号通路在颞叶内侧癫痫中的作用与机制

Aberrant activation of mTOR signaling pathway has been confirmed to be involved in the pathogenesis of mesial temporal lobe epilepsy. Recently, it has been found that mutation of DEPDC5, a negative regulator of mTOR, induce epilepsy by activating the mTOR pathway, but its mechanism remains unclear. In the previous study of our project, three rare variants of the DEPDC5 gene were found in patients with abnormally elevated mTOR expression in temporal lobe epilepsy. In silico structural model analysis revealed that one of the unreported missense mutations p.Trp1242Ala was located in the DEP functional domain，which preliminary confirmed its epileptogenic effect. However, how the DEPDC5 mutation affects the function of DEPDC5 protein, and the further dysregelation effect of mTOR pathway is not clear. Therefore, our project intends to use the surgical resection of hippocampal tissue in patients with temporal lobe epilepsy to study the effect of DEPDC5 mutation on DEPDC5 expression and mTOR signaling pathway activity, and further express and purify full-length DEPDC5 and other proteins in vitro, by means of protein interaction and structure, to explore the mechanism of mutated DEPDC5 protein in the pathogenesis of mTOR activation and medial temporal lobe epilepsy, for providing new ideas of elucidating the pathogenesis of temporal lobe epilepsy and finding new therapeutic targets.

mTOR信号通路异常激活已被证实参与颞叶内侧癫痫发病过程，目前研究发现mTOR上游负调控蛋白DEPDC5突变激活mTOR通路诱导癫痫发生，但其机制尚不明确。项目组前期研究发现mTOR表达异常升高的颞叶内侧癫痫患者中DEPDC5编码基因存在3个重复发生的突变，体外结构模型分析显示其中一个未见报道的错义突变p.Trp1242Ala位于DEP功能结构域，初步证实DEPDC5突变的致痫作用。然而DEPDC5基因突变如何影响DEPDC5蛋白功能，进而对mTOR通路产生失抑制作用尚不明确。因此，本项目拟利用颞叶内侧癫痫患者手术切除海马组织，研究DEPDC5突变对DEPDC5表达水平与mTOR信号通路活性的作用，并在体外表达纯化全长DEPDC5等蛋白，基于蛋白质相互作用及蛋白结构，探索突变DEPDC5蛋白参与mTOR活化及颞叶内侧癫痫的病理机制，为阐明颞叶内侧癫痫发病机制及寻找治疗新靶点提供新思路。

mTORC1信号通路的调控异常与癫痫的发生发展息息相关，多种参与mTORC1信号通路的基因变异可导致遗传性耐药性癫痫的重要发病。本项目原定计划拟阐明mTOR通路中Rags蛋白的调节蛋白DEPDC5对Rags蛋白的膜定位作用，因立项后国外有类似研究发表，项目转为探索mTORC1信号通路中另一感受器TM4SF5的调节机制。..mTORC1信号通路受由溶酶体内转运出的氨基酸所调节，故而可感知溶酶体内氨基酸浓度的感受器，以及能够将其转运出溶酶体转运体是能够触发 mTORC1信号通路的重要靶点。在mTORC1信号通路中，SLC38A9是溶酶体上的11次跨膜蛋白，被认为是精氨酸的转运体，而TM4SF5作为四跨膜蛋白超家族中的一员，与胞质精氨酸感受器castor1结合精氨酸的区域有着相似的氨基酸序列，所以被认为TM4SF5是能够精确感知溶酶体内精氨酸水平的感受器，并且TM4SF5可以与SLC38A9形成复合体，进一步将mTOR信号传递给下游。..综上所述，基于TM4SF5,SLC38A9在该信号通路当中发挥着重要的作用，通过对TM4SF5的表达纯化，以及TM4SF5与SLC38A9的体外组装，解析TM4SF5-SLC38A9复合体的三维结构，是阐明mTORC1通路中营养信号的传递，以及TM4SF5、SLC38A9在这一通路中发挥作用机制的关键所在。本项目采用昆虫细胞表达系统，利用HPLC筛选最适去垢剂条件，成功表达纯化了纯度较高，活性较好的TM4SF5蛋白、SLC38A9蛋白，为今后基于TM4SF5蛋白和SLC38A9蛋白的结构解析以及相关分子作用机制的研究提供了基础。目前，已发表相关文献，并申请了TM4SF5，SLC38A9蛋白纯化方法的专利。..基于本研究，在未来，项目拟构建TM4SF5蛋白的纳米抗体，将为靶向治疗耐药性癫痫提供新的思路与前景。..与此同时，该项目基金的部分成熟技术用于新冠单克隆抗体的研发，该项研究工作以S蛋白的RBD区域作为抗原来免疫大鼠，获得单克隆抗体。通过综合运用ELISA、Biocore、假病毒中和等实验方法以及冷冻电镜技术分别对单克隆抗体的中和效果和中和机制两方面进行详细阐述。其中有三类抗体可以同时结合在新冠病毒S蛋白的RBD区域，从而起到了良好的中和效果，为新冠病毒单克隆抗体的临床治疗提供新策略，新思路。该研究结果于2021年发表于MedComm杂