青枯菌生物素合成途径中一种新型甲酯庚二酸单酰ACP酯酶的鉴定及其生物学功能研究

Ralstonia solanacearum, a soil-borne plant pathogen, was famous by its devastating lethality that causes a bacterial wilt of many economically important plants such as tomato, potato and banana in the worldwide. Biotin is essential in all domains of life because it plays critical roles in central metabolic processes. Studies had revealed that biotin synthesis of human pathogen is involved in virulence factor. However, we still unknown about R. solanacearum biotin synthesis pathway and the role in its pathogenesis. In our study, we collect the first evidence that rsc0439 from R. solanacearum was importantly required in the biotin synthetic pathway by complement Rsc0439 in Escherichia coli biotin-auxotrophic strain. We thought that protein probably function as BioH that convert pimeloyl-ACP methyl ester to pimeloyl-ACP. This project will use R. solanacearum GMI1000 as the study object and further use in vitro biochemical assays and in vivo knockout strategies to study the function of rsc0439. The main methods include mass spectrometry, protein purification and in vitro DTB synthesis assay. The project aims to clarify the function of new identified esterase Rsc0439 and elucidate the mechanism for R. solanacearum biotin synthesis. What’s more, for the first time, investigating the biochemical mechanism for the synthesis of biotin as a virulence factor to provide a theoretical basis for the development and design new antibacterial agents targeting R. solanacearum-specific biotin synthesis.

青枯雷尔氏菌引起植物细菌性青枯病，在全球范围内给许多重要的经济作物和观赏性植物造成毁灭性的危害。生物素是细菌生长代谢所必需的辅酶因子，近来研究表明生物素在一些重要人类致病菌的侵染过程中发挥关键作用。但青枯雷尔氏菌的生物素合成途径仍不清楚，且与致病性的关系也尚未报道。本项目前期研究发现青枯雷尔氏菌中rsc0439基因可异体遗传互补大肠杆菌生物素合成途径中的甲酯庚二酸单酰ACP酯酶基因bioH，且rsc0439突变株是一种生物素营养缺陷型。本项目以青枯雷尔氏菌模式菌株GMI1000为研究对象，采用体外功能分析和体内基因敲除两种策略，运用质谱、蛋白质纯化、体外重建生物素合成等多种研究手段研究青枯菌rsc0439的生化功能及其在生物素合成中的作用，并首次探究生物素合成与植物致病菌致病性的关系。该项目旨在阐明青枯雷尔氏菌完整的生物素合成途径，为生化防治青枯病和寻求新型抗菌药物作用靶点提供理论基础。

生物素，又称维生素H，在所有生物体内的脱羧、羧化和转羧反应中起传递和固定CO2的作用。生物素是细菌生长所必需的辅酶因子，对细菌的生理代谢起着关键作用。近来有研究表明，生物素的生物合成与病原细菌的致病力密切相关。弗朗西斯菌借助生物素参与免疫逃逸，结核杆菌生物素合成被阻断后其生长受到抑制。而人等哺乳动物细胞无法自身合成生物素，只能从外界摄取，这使得细菌生物素合成途径成为一个极具潜力的可用来研发新型抗菌药物的靶标。.细菌生物素生物合成的关键问题是其前体物七碳单位庚二酸碳骨架的来源，已经研究透彻的是以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的BioC-BioH途径，首先BioC（邻-甲基转移酶）将SAM的甲基转移到丙二酸单酰-ACP的羧基形成甲酯丙二酸单酰-ACP，再借助细菌脂肪酸II型合成循环将碳链延长至含七碳的甲酯庚二酸单酰-ACP，之后通过BioH（甲酯酯酶）的水解生成甲酯庚二酸单酰-ACP作为为生物素合成前体，从而进入第二阶段生物素融合杂环合成过程，最终完成生物素的合成。而细菌生物素合成途径的多样性之一恰恰就表现在编码甲酯庚二酸单酰-ACP酯酶的BioH上。.为阐明更多细菌的生物素前体合成途径，丰富细菌生物素合成途径的多样性研究，我们通过异体遗传互补实验筛选、构建营养缺陷型菌株确证关键生物素合成基因、体外酶学生化反应以及体外重建生物素前体合成反应等手段，鉴定了多个具有种属特异性的甲酯庚二酸单酰-ACP酯酶，是生物素合成途径中的关键酶，分别是青枯雷尔氏菌（Rolstonia Solanacearum）RSC0439，查菲埃立克次体（Ehrlichia chaffeensis）BioU，卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）BstA，阐明了微生物生物素前体的生物合成途径，旨在完善和丰富细菌生物素代谢机制，为研发以抑制生物素合成为目标的新型专一性抗菌药物提供理论基础。