可溶性PD-1调节免疫细胞功能活性及其抗HBV效应的研究

PD-1/PD-L1通路是T细胞功能反向调节通路之一,阻断PD-1/PD-L1通路可一定程度恢复慢病毒感染中病毒特异性T细胞功能,并控制病毒感染.可溶性PD-1（PD-1胞外段结构域）可阻断肿瘤微环境中淋巴细胞表面PD-1与其配体结合，抑制PD-1/PD-L1信号传导，增强淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用。为了研究可溶性PD-1胞外段结构域对HBV特异性T细胞功能影响及其对HBV清除作用，我们拟应用分子克隆技术，构建PD-1胞外段结构域（sPD-1）腺病毒载体穿梭质粒，并包装sPD-1腺病毒表达载体。应用MTT法、细胞增殖实验、淋巴细胞体外刺激实验及体外细胞系和动物模型等，研究sPD-1恢复HBV特异性T细胞功能和控制HBV感染活性；本研究将为优化现有慢性HBV感染抗病毒策略和寻找新的抗病策略提供理论依据和实验基础。

乙型肝炎病毒（HBV）是一种非直接致肝细胞损伤病毒，感染后可导致急慢性感染。HBV慢性感染后可导致肝硬化、肝细胞癌发生，严重危害人类健康。至今为止的抗HBV治疗策略还不尽如人意。因此发展新的治疗策略具有重要意义..本研究首先应有分子克隆技术构建包含PD-1胞外端（21-168aa）腺病毒表达载体Ad- PDCD1-eGFP，并转染293细胞包装腺病毒，体外纯化获得腺病毒Ad- PDCD1-eGFP（病毒滴度为1*1011）。然后分别通过体外实验T细胞分化实验和体内注射腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染DC或直接注射腺病毒Ad- PDCD1-eGFP研究对其对HBV免疫耐受的作用。体外观察腺病毒Ad- PDCD1-eGFP对小鼠骨髓DC细胞增殖功能和生物活性因子分泌的影响，以及这种腺病毒感染DC对小鼠原代Th细胞（CD4CD62L）分化的影响发现腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染组同空病毒感染组和未加修饰DC组相比在抗原刺激后DC细胞高表达CD80、CD86、CD40、CDI-ab等共刺激因子和粘附因子；ELISA检测培养上清发现同对照组相比，腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染者分泌高水平IL-12，而IL-10水平同对照比相比未见明显变化。进一步将腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染DC于体外同小鼠原代T细胞CD4CD62L+T）共培养后，流式检测CD4+CD25+FOXP3+T细胞比例明显高于对照组。基于以上体外研究结果可以初步证实腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染DC细胞可调节原代T细胞分化方向，抑制Treg细胞，Th2细胞分化。进一步将腺病毒Ad- PDCD1-eGFP感染DC经HBV特异性性多肽激活后免疫注射HBV转基因小鼠，检测小鼠外周血HBsAg和HBV DNA水平发现可明显降低HBsAg和HBV DNA水平。以上研究结果提示：sPD-1修饰DC可有效打破HBV免疫耐受，有效降低HBsAg和HBV DNA水平，是具有一定潜力的治疗策略。