新HBcAg特异性B细胞表位的分析及其特异性抗体作用机制的研究

Our previous work from two randomized controlled studies has demonstrated that pretreatment quantitative hepatitis B core antibody (qAnti-HBc) could predict HBeAg seroconversion after antiviral treatment independently (Fan Rong, et al. Gut, 2016). However, the prediction of HBcAg specific B cell epitope for HBeAg seroconversion as well as the function of its specific antibody among chronic hepatitis B virus (HBV) infected patients remain unclear. In this study, we plan to map the immunodominant epitope distribution of HBcAg specific B cell and its dynamic evolution during antiviral treatment among chronic HBV infected patients by using ELISA, flow cytometry and B cell receptor high-throughput sequencing, in order to find out novel epitope of HBcAg specific B cell as predictor of HBeAg seroconversion or HBsAg loss, and to evaluate the characteristics of immunodominant epitope specific B cell as well as its relationship with treatment outcome. And then, we plan to produce monoclonal antibody of HBcAg by using hybridoma technique and mammalian cell surface display technology, and identify the function of monoclonal antibody of HBcAg by in vitro study and HBV mice model. Our study will help to establish theoretical basis for the development of therapeutic monoclonal antibodies and provide clues for immunotherapy of chronic HBV infected patients.

我们前期在两项随机对照临床研究中发现治疗前Anti-HBc定量能独立预测抗病毒治疗后HBeAg血清学转换（樊蓉，等，GUT 2016），但慢性HBV感染者抗病毒过程中Anti-HBc相应B细胞表位对HBeAg血清学转换的预测作用以及该表位特异性抗体功能尚不清楚。本项目拟通过ELISA、流式细胞术和B细胞受体深度测序等技术，研究慢性HBV感染者HBcAg特异性B细胞优势表位分布及抗病毒治疗过程中的动态演变，以寻找到可预测HBeAg血清学转换和HBsAg转阴的新HBcAg 特异性B细胞表位，并阐明优势表位特异性B细胞在慢性HBV感染者中的特点以及与预后的关系。然后通过杂交瘤技术和哺乳动物细胞表面展示技术制备HBcAg单克隆抗体，再进一步通过体外实验和小鼠体内实验鉴定出有中和作用和治疗价值的HBcAg单克隆抗体，为治疗性单克隆抗体的开发提供理论依据，并为慢性HBV感染免疫治疗提供新策略。

慢性乙型病毒性肝炎患者需要长期抗病毒治疗，与目前抗病毒药物治疗效果欠佳和患者免疫无法完全控制病毒复制有关。寻找预测抗病毒治疗疗效的指标对于慢性乙型病毒性肝炎患者的治疗是十分必要的。许多研究表明，乙型肝炎核心抗体（qAnti-HBc）的定量水平是慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗效果的新预测指标。然而，关于抗-HBc控制HBV感染的相关免疫机制知之甚少。本课题研究目的是通过分析宿主免疫反应水平和Anti-HBc之间的关系来阐明Anti-HBc水平预测抗病毒疗效的原因，然后研究Anti-HBc亚型以及线性表位以了解其特点，通过体外实验和动物实验研究Anti-HBc产生的机制，通过慢乙肝患者抗病毒治疗临床队列和体外实验探讨Anti-HBc与抗病毒作用之间的关系。最终研发鼠源性单克隆Anti-HBc，筛选出具有抗病毒功效的单克隆抗体。我们发现 IgG1 和 IgG3 的Anti-HBc水平比总Anti-HBc 水平表现出更好的预测值，并且在肝炎患者中发现Anti-HBc的总、IgM和IgG1亚型水平升高，并伴有Anti-HBc的多表位，这是由受损肝细胞释放的HBcAg的刺激引起的。并且发现Anti-HBc 水平与效应细胞和HBV 核心特异性CD8+ T 细胞的频率之间存在强相关性。体外实验表明，在 B 细胞的帮助下HBcAg可以有效地激活T细胞。此外，Anti-HBc 通过进入HepG2.2.15细胞并介导补体激活以抑制HBV在体外复制，从而显示出直接的 HBV 抑制作用。最后我们研发的鼠源性单克隆Anti-HBc体外具有抗HBV功效，并显示出浓度依赖效应。总之，Anti-HBc不仅是激活适应性免疫的生物标志物，也是潜在的HBV抗病毒药物。因此，更好地了解Anti-HBc 可能有助于开发抗HBV治疗的新方法。