曲霉属特异性甘露聚糖蛋白的鉴定及B 细胞抗原表位分析

在曲霉检测技术研究中，本室建立了一种特异性检测多种曲霉的双抗夹心法。根据其检测临床标本，感染动物模型，以及与商用半乳甘露聚糖检测实验比较结果推测：本法检测的是侵袭性曲霉感染早期释放出的循环抗原；该抗原可能是一种曲霉属特异性甘露聚糖蛋白，并且在曲霉对宿主的侵袭或逃避机制中起一定作用。它有望成为新的侵袭性曲霉感染诊断标志物和防治靶标。为鉴定该抗原编码基因及生物学特征，拟首先运用免疫沉淀技术分离靶抗原；再通过双向电泳、N末端序列测定、cDNA表达文库筛选、质谱分析以及生物信息学技术鉴定其理化性质及编码基因；然后通过噬菌体随机肽库技术、免疫印迹技术、ELISA技术及序列比对技术分析靶抗原B细胞表位分布、性质及肽表位骨架结构特征。并通过动物实验观察其肽表位的免疫原性。本研究将为发展满足临床需求的侵袭性曲霉病诊疗新技术奠定基础。

在2008年至2011年侵袭性曲霉感染早期诊断检测技术研究中，本室建立了一种特异性检测多种曲霉的双抗夹心法。根据其检测曲霉（临床分离株和环境分离株）培养上清液,少量临床标本，感染动物模型血清，以及与商用半乳甘露聚糖检测实验(GM实验)比较，结果表明该方法的特异性和敏感性与GM实验相当。据此我们推测：该方法检测的是侵袭性曲霉感染早期释放出的循环抗原；该抗原可能是一种曲霉属特异性甘露聚糖蛋白，并且在曲霉对宿主的侵袭或逃避机制中起一定作用。它有望成为新的侵袭性曲霉感染诊断标志物和防治靶标。因此本项目以该靶抗原为主要研究对象，希望通过对该靶抗原的深入研究为发展满足临床需求的侵袭性曲霉病早期诊断新技术提供帮助。.我们首先通过免疫沉淀技术分离靶抗原，通过N末端测序技术、质谱技术获取其部分氨基酸序列信息。以特异性抗体筛选烟曲霉cDNA表达文库，测定阳性克隆的DNA序列。将上述氨基酸序列信息和DNA序列信息与烟曲霉的全基因组序列信息进行比对分析，以鉴定靶抗原的编码基因。结果发现，通过不同途径分析得出的靶抗原的编码基因序列信息不相符。接下来，我们又用多种其他方法对这种曲霉属特异性甘露聚糖蛋白进行了鉴定。同时，我们还建立了一种通过质谱技术鉴定5种常见曲霉的方法，在优化的体系下（培养基，培养时间，培养温度，前处理方法等），鉴定准确度达99.9%。另外，我们还对临床收集的965份标本（其中IA患者血清78份,）进行了多种检测方法的比对分析，比对方法包括GM实验，本研究前期工作中建立的双抗体夹心法，以及本室其他研究人员建立的Afmp1p抗原捕获ELISA方法、Afmp4p抗原捕获ELISA方法、检测anti-Afmp1cr/Afmp2cr抗体的双抗原夹心ELISA方法。大样本检测结果表明，本研究前期工作中建立的双抗体夹心法虽然检测特异性优于传统的GM实验，但是该方法检测阳性的病例无一存活，这表明当患者血液中出现本研究预期的标志物（曲霉属特异性甘露聚糖抗原，即靶抗原）时，患者已进入IA的终末期。上述实验数据还表明，多种方法联合检测可能是IA早期诊断的发展方向。因前期质谱鉴定曲霉菌工作进展较顺利，在课题结题前我们还进行了应用质谱技术分析侵袭性曲霉感染患者，非侵袭性曲霉感染患者、健康体检者血清谱图的尝试。以期能发现一种基于质谱分析技术的侵袭性曲霉感染早期诊断新方法。