基因编辑肌卫星细胞治疗X连锁隐性遗传肌管肌病小鼠的研究

X-linked recessive myotubular myopathy (XLMTM) belongs to a member of a well-defined subgroup of the centronuclear myopathies, which is a severe fatal X-linked inherited muscle disorder. No effective therapy is available until now. This genetic disorder is due to loss of function mutations in myotubularin encoded by MTM1. Skeletal satellite cells (SCs) are the most abundant skeletal muscle stem cells，which are activated and undergo proliferation and differentiation to form new myofibers and regenerate functional skeletal muscles. Recently, we established a system selectively expanded adult mouse SCs from bulk skeletal muscle preparations. The CRISP/Cas9-based genome editing is a promising technology for correcting genetic alterations in mutant genes. And In this study, we performed selection and primary expansion of SCs, followed by customized genome editing through CRISPR/Cas9 technology, and secondary expansion to propagate the repaired SCs in XLMTMMtm1-D5. Our studies established a reliable and feasible platform for gene correction in SCs by genome editing, thus greatly advancing tissue stem cell-based therapies for XLMTM and other muscle disorders.

X连锁隐性遗传肌管肌病（XLMTM）属于中央核肌病，是一种严重的遗传骨骼肌疾病，致病基因MTM1。目前临床上尚无有效治疗手段。肌卫星细胞（SCs）是最多见的骨骼肌干细胞，激活后具有分化、修复骨骼肌的能力，是一种理想的治疗遗传性骨骼肌疾病的种子细胞。为此，我们前期发展了高效的体外扩增肌卫星细胞的方法。CRISP/Cas9基因编辑技术是目前最有潜力的基因编辑工具能够对目的基因精确编辑。文献报道及我们前期的临床研究表明，MTM1突变形式多为点突变，可进行基因编辑。因此本课题将利用XLMTMMtm1-D5动物模型，建立基于SCs平台，使用CRISPR/Cas9定点基因编辑，结合SCs移植进行个体化治疗XLMTM的新策略，为干细胞联合基因治疗XLMTM及其他遗传性骨骼肌疾病的临床转化奠定基础。

X连锁隐性遗传肌管肌病为单基因遗传性神经肌肉病，致病基因为MTM1，系该类疾病中最严重的一型。XLMTM的致病基因MTM1编码肌微管素蛋白，主要表达于肌肉组织，是肌原纤维系统中的关键维系蛋白并且在骨骼肌兴奋-收缩偶联中发挥重要作用。肌卫星细胞（satellite cells, SCs）是一种骨骼肌干细胞，在骨骼肌受损时，SCs可增殖、分化，最终形成肌纤维，具有巨大的研究利用价值。MTM1 定位于 X 染色体长臂 28（Xq28），包含 15 个外显子前期研究表明MTM1 突变形式主要为点突变及截断突变，可通过基因编辑原位修复，恢复全部基因功能。本研究将该模型鼠肌卫星细胞体外培养，利用 CRIPSR/Cas9 基因编辑技术，在体外对 SCs 中的突变基因靶向修正后，再将修正的 SCs 回输到模型鼠体内，进行治疗，为间接体内途径进行 Mtm1 基因治疗研究奠定坚实的基础，同时也为利用 XLMTM 患者基因编辑自体 SCs 联合 SCs 移植进行基因治疗开辟一条新的思路，为 SCs 临床应用治疗此类遗传性骨骼肌疾病提供新的思路和依据。