自噬基因Wipi家族对神经退行性疾病影响的机制研究

Autophagy is an evolutionarily conserved lysosome-mediated degradation process, involving formation of an enclosed double membrane structure, called autophagosome, and its subsequent delivery to lysosomes for degradation. Previous studies and our findings demonstrated that knockout of early autophagy genes, Atg5, Atg7 or Ei24, cause massive neuron loss, while loss of Epg5, an autophagy gene functioning at late step, showed selective motor neuron loss and muscle atrophy, key features of ALS. These results suggest that different autophagy gene deficiency invovles in distinct neurodegeneration. WIPI4, encoding a WD40 repeat-containing PtdIns(3)P binding protein, is essential for the basal autophagy pathway. Mutations in WIPI4 cause the neurodegenerative disease BPAN, a subtype of NBIA. We plan to generate CNS-specific Wipi4 knockout mice to investigate the mechanism of Wipi4 in neurodegeneration. Wipi protein family has other three members, WIPI1-3. We plan to generate Wipi1-3-deficient mice to study the functional difference and redundancy of these genes. To study the effect of autophagy on different neural cells, we plan to generate different neuron, astrocyte and oligodendrocyte-specific autophagy gene Atg5 or Ei24 knockout mice, and investigate their contribution to neurodegeneration.

自噬是一种溶酶体介导的降解系统，在进化上高度保守。自噬过程首先形成自噬小体，自噬小体成熟后与溶酶体融合并降解其内容物。我们的前期研究发现自噬早期基因Ei24缺失可以引起广泛性神经元缺失，而自噬晚期基因Epg5缺失引起特异性运动神经元缺失，与ALS的表型相似。这些结果提示自噬不同阶段的基因缺失可以引起不同类型的神经退行性改变。WIPI家族蛋白具有PtdIns(3)P结合活性，对于基础水平自噬非常重要。WIPI4基因突变可以引起一种特殊的神经退行性疾病BPAN，这是一种NBIA疾病。我们拟构建特异性中枢神经系统Wipi4敲除小鼠，研究Wipi4缺失引起神经退行性疾病的机制，同时构建Wipi1-3基因敲除小鼠以观察四个Wipi基因之间功能的不同和联系。为了研究自噬对不同类型神经细胞的影响，我们拟构建特异不同神经细胞中敲除自噬基因的小鼠，研究不同神经细胞自噬缺失如何引起神经退行性改变。

细胞自噬是一种高度保守的细胞保护机制，通过溶酶体介导的降解途径清除聚集的蛋白质和受损的细胞器。细胞自噬过程需要由III型PI3K复合物产生PtdIns3P，并在此基础上形成双层膜结构的自噬小体。WIPI（包含WD重复序列的PtdIns3P结合蛋白）家族蛋白即为自噬通路中的PtddIns3P效应蛋白。人类的WIPI蛋白家族包括WIPI1-4。WIPI蛋白又分为两个亚类，WIPI1/2和WIPI3/4（WIPI4也称WDR45）。为了研究这些蛋白在哺乳动物中的功能，我们构建了Wipi1、2和Wdr45基因敲除小鼠。结果发现Wipi1敲除小鼠没有明显异常。Wipi2敲除小鼠与其他自噬基因敲除小鼠一样出现吮吸异常，生后24小时内即死亡。组织免疫荧光染色结果也显示Wipi2敲除小鼠各组织内自噬底物SQSTM1/p62和ubiquitin阳性蛋白大量累积。这些结果说明WIPI2是自噬通路的核心蛋白 之一。而 Wdr45敲除小鼠只出现了较弱的自噬异常。 而Wdr45敲除小鼠出现明显的学习和记忆功能障碍，运动功能晚期也出现部分损伤。Wipi4敲除小鼠脑内p62主要累积在神经元内。由于WIPI3和WIPI4序列高度相似，所以两个蛋白很可能功能上互相代偿。结论，本研究发现哺乳动物尤其神经系统内WIPI1、2和4蛋白发挥着不同功能。