尿素通道蛋白作为新型利尿药作用靶标的确认及其活性化合物的结构优化

Urea transporters are a group of membrane proteins that are specifically permeable to urea. They mediate the intrarenal urea recycling to play an important role in urine concentration. Previous work showed that knockout of urea transporters resulted in urea-related urine concentration defect, but did not affect electrolyte balance. Therefore, we propose that urea transporters may act as new diuretic drug targets, and that urea transporter inhibitors can be used as new diuretics. These new diuretics would not cause electrolyte disturbance. Our previous work showed that a new urea transporter inhibitor PU-14 had significant diuretic effect without affecting blood Na+, K+ and Cl- concentrations. Based on the crystal structure of a urea transporter (UT-B) and the chemical characteristics of active compounds, this project aims to determine the active sites and mechanism of active compounds interacting with urea transporters using structure-activity relationship analysis, molecular docking, site-directed mutagenesis, chemical structure modification, complex crystal structure determination and three-dimensional structure directed rational drug design. The purpose of this study is to determine the feasibility of urea transporters as novel diuretic drug targets and to discover lead compounds of novel diuretics with excellent pharmacological characteristics.

尿素通道是特异性通透尿素的跨膜蛋白，在肾脏尿浓缩机制中发挥重要作用。前期工作发现尿素通道功能性敲除可导致尿素选择性利尿，且不引起钠、钾、氯离子丢失和蓄积。因此，我们提出“尿素通道蛋白可作为新的利尿药作用靶点，其抑制剂可研发成为新型利尿药”的科学假说，其优势在于“利尿作用不影响机体电解质平衡”。本项目拟在发现活性化合物优替作为尿素通道抑制剂，在体内具有尿素选择性利尿作用,并不引起血钠、钾、氯水平改变的前期工作基础上，利用药物设计的基本原理对先导化合物优替进行结构优化；通过研究尿素通道蛋白与优替复合物的三维结构，借助于计算机虚拟分子对接技术发现新结构类型的利尿药；利用尿素通道蛋白基因定点突变、化合物药理学评价等技术，研究活性化合物在尿素通道蛋白上的作用位点和作用机理。本研究的目标是确定尿素通道蛋白作为新型利尿药作用靶点的可行性，获得药理学特性优良的新型利尿药先导化合物。

尿素通道（UT）是特异性通透尿素的跨膜蛋白，在肾脏尿浓缩机制中发挥重要作用。前期工作发现尿素通道功能性敲除可导致尿素选择性利尿，且不引起钠、钾、氯离子丢失和蓄积。因此，我们提出“尿素通道蛋白可作为新的利尿药作用靶点，其抑制剂可研发成为新型利尿药”的科学假说，其优势在于“利尿作用不影响机体电解质平衡”。.本项目对已发现的噻吩并喹啉类化合物进行结构优化和改造，获得了IC50在微摩尔以下具有噻吩并吡啶母核的活性化合物SAZ-cb20，其对小鼠、大鼠和人的UT-B均具有较强抑制活性，半数抑制剂量IC50分别为2.01μM、0.47μM和 0.23μM。.计算机虚拟实验提示UT抑制剂作用位点在UT-B蛋白细胞膜外侧尿素结合位点旁的交叉螺旋环。UT抑制剂与ASN289形成氢键和LEU285 和ALA327形成很强的范德华力和疏水作用，分子动力学模拟预测PU以铆钉的方式结合在UT-B的功能对接基团（FGD），抑制UT-B通透尿素，从而发挥其对UT-B的抑制作用。.为了获得成药性更好的小分子尿素通道抑制剂，我们以上述工作为基础，从小分子化合物库中再次筛选了1040种成药性较高的化合物，发现两个母核为二芳基酰胺的化合物具有明显的UT-B抑制活性。我们对该类化合物进行结构改造，获得具有较强UT-B抑制活性的化合物50个，其中Y2对小鼠、大鼠和人的UT-B半数抑制剂量IC50分别为1.60μM、0.99μM和0.25μM。.体内实验发现，灌胃给Y2后2小时内，小鼠单位时间排尿量便开始升高，2~4小时尿量达到峰值，且尿渗透压显著降低。皮下给药相对灌胃给药利尿效果更佳。连续灌胃给药7天，其利尿效果较为稳定。尿液中Na+、K+和Cl-单位时间排泄量没有明显变化，且血中Na+、K+和Cl-水平也无明显变化，表明Y2产生的利尿作用机制是抑制肾内尿素循环中尿素通道蛋白的作用所致尿浓缩能力降低所致，在产生利尿效果的同时不引起明显的Na+、K+和Cl-离子丢失。.综上所述，本研究发现了新型尿素通道抑制剂，其通过改变肾内尿素循环过程，产生“尿素选择性利尿”，不影响电解质平衡，弥补了经典利尿药引起电解质紊乱的缺点。二芳基酰胺类化合物Y2与我们前期工作发现的尿素通道抑制剂PU系列相比，口服有效，大大地提高了尿素通道抑制剂的成药性。本研究为尿素通道抑制剂作为利尿药进行新药临床前研究提供了理论依据和实验基础。