尿素通道作为治疗肝硬化腹水药物靶点的确认及其抑制剂PU-48的药效学研究

Liver cirrhosis ascites (LCA) is an edema disease with the characteristics of the water and sodium retention. During clinical practice, the classical diuretics are often used in the treatment of LCA, the long-time application of which may induce electrolyte disturbance such as hyperkalmia, hepatorenal syndrome and even hepatic encephalopathy. Urea transporters are a group of membrane proteins specifically permeable to urea. They play an important role in modulating the intrarenal urea recycling during urine concentration. Our previous work showed urea transporter inhibitor PU-48 can significantly suppress the function of urea transporter, resulting in dramatic urea-selective diuresis without disturbing the electrolyte balance. In this study, a self-designed urea-transporter-null LCA mouse model will be used to identify the urea transporter as a drug target of LCA. Then a rat LCA model is established to investigate the therapeutic effect and mechanism of PU-48 on LCA and its side effect on liver and other organs. The pharmaceutical advantage of PU-48 will be clarified in the treatment of LCA compared with spironolactone, furosemide and tolvaptan. The safety, effectiveness and adverse effect of combined administration of PU-48 and spironolactone will also be discussed. This study will provide convincible theoretical foundation and detailed experimental information on pharmacological effect of PU-48 on LCA.

肝硬化腹水是以水钠潴留为特征的水肿性疾病。长期使用经典利尿药治疗肝硬化腹水会导致高血钾等电解质平衡紊乱的现象，严重者可以诱发肝性脑病和肝肾综合征。尿素通道是特异性通透尿素的膜蛋白，在尿浓缩机制中发挥重要作用，其功能性抑制可导致尿素选择性利尿。本项目前期研究发现尿素通道特异性抑制剂PU-48具有显著的尿素选择性利尿活性，且不引起电解质平衡紊乱。本项目拟利用尿素通道敲除小鼠制备肝硬化腹水模型，验证尿素通道作为治疗肝硬化腹水药物靶点的可行性；探索PU-48对大鼠肝硬化腹水的治疗作用和机制，以及对肝脏及肝外组织功能的影响；论证PU-48相较于螺内酯、呋塞米、托伐普坦等利尿药的药理学优势；并在动物模型水平上探讨PU-48与螺内酯合用治疗肝硬化腹水的安全性、有效性和副作用。本项目研究成果将为尿素通道抑制剂研发成为治疗肝硬化腹水和其他低钠水肿性疾病的新药提供坚实的理论依据和实验基础。

肾脏纤维化是终末期肾病的最典型表现。肾脏间质的肌成纤维细胞分泌过多的细胞外基质是导致肾纤维化的主要原因。其中肾小管上皮细胞通过表皮基质转移 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）获得肌成纤维细胞的特征被认为是导致CKD肾纤维化的主要原因之一。交感神经末梢通过其分泌的神经递质去甲肾上腺素（NE）可以直接调节肾脏的血管系统，影响肾小管上皮细胞的功能。慢性肾病患者的血清NE、交感神经活性和血清肾素活性显著升高。研究表明，在肾纤维化小鼠模型中，肾交感神经活性与肾间质纤维化水平密切相关。但是肾脏交感神经是否可以通过调节肾小管上皮细胞EMT导致肾脏纤维化及其相关机制还不清楚。.本研究的主要研究内容旨在明确交感神经递质NE导致肾小管上皮细胞发生EMT及其促纤维化的作用，解析参与NE相关的肾小管上皮细胞EMT过程的交感神经受体亚型及其偶联的G蛋白受体，探讨交感神经促进TGF-β1介导的肾纤维化的具体分子机制，阐明阻断交感神经相关通路对TGF-β1介导的肾纤维化的保护作用。.在给予人肾小管上皮细胞（HK-2）NE刺激后发现其可以协同TGF-β1，促进肾小管上皮细胞EMT过程。由于交感神经受体属于G蛋白偶联受体，因此利用不同的Ga蛋白抑制剂，发现NE 通过Gαq介导HK-2的EMT过程。通过基因敲降和抑制剂等手段发现，阻断交感神经受体α1（α1-AR）可以显著抑制HK-2的EMT表型，减轻纤维化蛋白的表达水平。在进一步的机制分析中发现，交感神经作用于α1-AR后激活p38，磷酸化p38与TGF-β1/Smad3信号通路协同促进肾小管上皮细胞EMT，进而导致肾间质纤维化。在肾纤维化小鼠模型中，给予α1-AR抑制剂坦索罗辛可以显著降低磷酸化p38和Smad3的表达水平，明显改善肾间质纤维化水平。.本研究解析了交感神经诱导肾间质纤维化的具体机制，验证α1-AR/ Gαq/p38/ Smad3信号通路假说。α1-AR抑制剂坦索罗辛有望成为治疗肾纤维化的新型治疗药物。