OsmTERF2-1调控水稻叶绿体基因转录终止机制

The mitochondrial transcription termination factor (mTERF) family proteins act on transcription termination of genes in chloroplasts and mitochondria and play an important role in organelles development. An albino mutant was isolated by forward genetic approach in our previous study. Sequencing showed a two-base deletion of OsmTERF2-1 gene in mutant. Deletion of OsmTERF2-1 gene by CRISPR/Cas9 in rice exhibited similar phenotype with mutant. OsmTERF2-1 locates in chloroplasts by transient protoplast transformation experiment. Expressions of chloroplast genes were severely disturbed in osmterf2-1 mutant, while the mechanism remains unknown. Further research will focus on: 1) Investigating the binding sites between OsmTERF2-1 and Chloroplast genes by CHIP. 2) We previously screened NEP was one of interactive proteins with OsmTERF2-1 by the yeast two hybrid system. Further confirmation will be performed in this project by BiFC. Next, we will try to isolate the NEP transcription termination complex. 3) It is important to confirm whether OsmTERF2-1 can hydrolyze ATP. 4) Generating the induced RNAi-OsmTERF2-1 and RNAi-NEP transgenic plants and analyzing the expressions of Chloroplast genes during different growth stage using the transgenic plants. This research will contribute to not only illustrate the regulative mechanism of chloroplast transcription termination, but also offer potential solutions for increasing photosynthesis efficiency.

线粒体转录终止因子家族基因调节线粒体和叶绿体基因的转录终止，对细胞器的发育起重要作用。通过正向遗传学，图位克隆了一个水稻白化突变基因，测序表明是OsmTERF2-1基因突变造成。CRISPR/Cas9敲除该正常基因可重现突变表型。瞬时表达表明OsmTERF2-1位于叶绿体，osmterf2-1突变体中叶绿体基因表达受影响，但机理不清楚。本项目将开展：1）通过染色质免疫共沉淀等方法鉴定OsmTERF2-1与叶绿体基因组的结合位点；2）通过BiFC确认OsmTERF2-1与核编码的RNA聚合酶（NEP）互作关系，并分离NEP转录终止复合物；3）确认OsmTERF2-1是否具有ATP酶活力；4)构建OsmTERF2-1和NEP诱导型干涉株系，定量分析OsmTERF2-1和NEP对不同时期叶绿体基因表达的调控模式。该研究对完善叶绿体转录终止调控机制有重要的科学意义，也为提高作物光合效率提供可能。

本课题通过正向遗传学，图位克隆了一个水稻白化突变基因mTERF (Mitochondrial Transcription Termination Factor)。CRISPR/Cas9敲除该正常基因可重现突变表型。亚细胞定位显示该OsmTERF蛋白在叶绿体中发挥功能。该基因突变后会引起叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量大幅度下降。透射电镜显示，突变体的叶肉细胞相对于野生型细胞轮廓更加不规则，且叶绿体发育异常；与野生型堆叠成垛的基粒类囊体结构相比，突变体仅有少数未发育成为类囊体的小球状质体结构。对该基因的表达图谱分析发现，该基因在叶中具有高表达，在根中表达量很低。以编码序列设计定量引物发现该基因的表达存在周期节律。通过RACE实验发现，该OsmTERF存在5种转录本，其中四种转录本的编码框不变，差异区域为3’UTR区，第五种转录本不存在编码序列。对具有编码框的四种转录本设计引物定量分析发现，四种转录本的转录存在较大差异。转录本1、2的表达相似，而转录本3、4的表达相似，但与转录本1、2呈现不同的规律。.为了探究OsmTERF的作用机制，我们通过酵母双杂交系统筛选到一个OsmTERF的互作候选蛋白-NEP(Nucleus-Encoded RNA polymerase)。亚细胞定位显示该蛋白作用于叶绿体。通过RACE实验发现该基因存在四种转录本，四种转录本的编码框的起始密码子呈不同程度的缩进，因此导致产生四种不同长短的编码蛋白。通过全长酵母双杂交实验发现，OsmTERF可以与三种截断的NEP蛋白互作，Pull-down实验显示OsmTERF与四种NEP蛋白均可以发生互作。CRISPR/Cas9敲除该NEP基因也可获得白化突变表型。.OsmTERF通过与NEP互作引起植株白化，具体影响了哪些基因的表达值得探究。通过对叶绿体51个基因的表达进行定量分析发现，大部分的叶绿体基因的表达都受到了影响。对17个影响较大的基因的调控区域与OsmTERF酵母单杂实验均没有发现互作现象说明，OsmTERF很可能不是通过结合DNA的方式参与转录终止调控。