拟南芥DNA拓扑异构酶TOP1α通过对细胞分裂素基因的表观调控影响RAM维持的分子机制研究

DNA topoisomerases are involved in multiple biological processes, which are very important for development and cell division. Seldom researches focus on the study of DNA topoisomerase mechanism in Arabidopsis. We isolated a mutant top1α, which encodes DNA topoisomerase I, by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis screening in Arabidopsis and map-based cloning. top1α has pleiotropic phenotype, among which is root apical meristem (RAM) maintenance defect. RNA-seq results show that TOP1 can influence a large amount of genes expression, including cytokinin related genes. Root growth of wild type is inhibited while root growth of top1α is promoted by cytokinin treatment. We propose that TOP1α might modulate RAM maintenance by epigenetic regulation on these cytokinin related genes. Our goal is to study the molecular mechanism of TOP1α regulating RAM maintenance. First we plan to confirm these cytokinin related genes participate in TOP1α maintaining RAM activity. Then we will define which pathway TOP1α modulates to maintain RAM activity. Next we will test how TOP1α influence RNA polymerse II (Pol II) binding to cytokinin related genes, nucleosome position and histone modifications on these genes. Finally we will check if chromatin remodeler FAS1/FAS2 can affect TOP1α binding to these cytokinin related genes. Based on our previous data and research plan, we’ll discover the mechanism of how TOP1α manipulating cytokinin related genes to maintain RAM activity, which will provide a new link between cytokinin, epigenetics, and root developemt.

DNA拓扑异构酶参与了多种重要生物过程，对真核生物发育和细胞分裂不可缺少。拟南芥中关于DNA拓扑异构酶的作用机制知之甚少。前期的研究中，我们通过对拟南芥EMS诱变, 筛选到一个编码DNA拓扑异构酶I TOP1α的突变体。该突变体具有根顶端分生组织的维持缺陷；RNA-seq分析表明TOP1α影响了基因表达，尤其是与细胞分裂素相关基因的表达；外源细胞分裂素处理能促进top1α主根生长。说明细胞分裂素可能参与了TOP1α调控RAM的维持。本项目将重点研究此过程的分子机制：验证这些细胞分裂素基因参与TOP1α对RAM维持的调控；检测TOP1α对这些基因在染色质水平的影响；检测TOP1α对这些基因的结合是否受到染色质重塑因子的影响。综合以上的实验结果和实验设计，我们将揭示细胞分裂素参与的TOP1α对RAM维持的表观遗传调控机制。这一项目将植物激素途径和表观遗传调控相结合，为研究根发育提供新的视角。

根的向重力性对植物的生长起着重要的作用，它可以促进根在土壤中的深扎，有助于植物的固着以及对水分和养分的吸收。根冠区的淀粉粒细胞感受重力信号，通过信号级联，将生长素信号传递至伸长区，在伸长区介导根响应重力刺激下的生长。可代谢糖通过细胞分裂素，生长素等多种激素参与根的向重力性调控。DNA拓扑异构酶Ia (DNA topoisomerase Ia, TOP1a)是植物发育不可缺少的一种核酶，参与调控DNA转录、复制和染色质重塑等重要的生物学过程，而目前关于TOP1a对根向重力性的表观调控还鲜见报道。.前期工作中，我们通过EMS诱变分离鉴定了一个编码DNA拓扑异构酶Ia的突变体top1a，其根在蔗糖处理条件下严重卷曲。为了探究引起这一向重力性缺陷的机制，我们从植物生理学、细胞生物学、遗传学、分子生物学等多个生物学水平上进行探究，其主要结果如下：.（1）建立了蔗糖处理体系。 3%蔗糖处理下的 top1a根向重力性生长具有严重缺陷。转基因恢复实验表明，该缺陷是由于TOP1a的缺失引起的；.（2）等渗实验实验表明， top1a根向重力性生长缺陷可能是由蔗糖的糖信号引起的；.（3）3%蔗糖处理下的top1a淀粉粒细胞排列紊乱，且小柱干细胞严重分化。定量PCR及报告基因表达分析显示，可能是由于TOP1a通过糖信号通路影响了WOX5/ PLT2的表达模式所致；.（4）35S::DII-venus生长素感应系统显示，3%蔗糖处理下的top1a的根尖在响应重力刺激时，生长素不对称建立的缺陷，可能是由于PIN3和PIN7在响应重力刺激时，极性重定位延迟导致的；.（5）定量PCR结果显示，在3%蔗糖处理下的top1a中，参与PINs蛋白极性定位运输的GNL1表达量明显降低，其转录起始区核小体密度增加，且TOP1a可以结合该区域。.根据这些结果，我们推测TOP1a在蔗糖处理条件下，通过直接作用于GNL1的转录起始区表观调控基因的表达，使重力刺激时PIN3和PIN7在小柱细胞及时进行重定位，进而促使生长素的重分布，最终参与糖信号通路中根的重力性调控。.本课题研究了糖信号参与的根向重力性的调节，通过不同的层次和水平的生物学方法，从表观水平解析其具体的调控机制，为根的向重力性的研究提供了新的研究视角。