长链非编码RNA HULC促发细胞自噬调控人类干细胞恶性分化的机制研究

Our preliminary studies have shown that long noncoding RNA HULC plays a role in tumor progression dependent on autophagy. This study intends to isolate and induce stem cells (including cancer stem cells), and to analyze the effect of HULC on the malignant phenotype of stem cells in vitro and in vivo. Then, we will focus on the analysis of the regulatory mechanism of HULC on autophagy in stem cells, including to analyze how HULC leads to alter the expression and function of autophagy related gene P62 dependent on miR15a in stem cells and how HULC regulates the function of autophagy structure gene LC3, which influences on the formation and assembly of autophagic bodies in stem cells. The vital argument is to demonstrate how HULC can selectively degrade proteins or protect gene expression via autophagy cooperation to P62. We also analyzed the mechanism of the malignant differentiation of stem cells induced by the resulting change of related genes using high throughput analysis. Finally , based on autophagy, the effect of HULC on the dynamic expression of valuable genes,　signaling networks, epigenetic modification , nucleic acid and protein should be confirmed, and thus triggered chromatin reprogramming and chromatin instability should be explored in the stem cells. We will try to reveal the important functions of HULC in the regulation and control of malignant differentiation of stem cells based on autophagy.

前期研究显示长链非编码RNA HULC依赖细胞自噬在肿瘤进展中起作用。本研究拟分离、诱导干细胞（包括肿瘤干细胞），并分析HULC对干细胞体内外恶性表型的影响。然后解析HULC对干细胞中细胞自噬的调控机制，包括HULC怎样依赖miR15a导致干细胞中细胞自噬相关基因P62表达及功能的改变？HULC 怎样调控细胞自噬结构基因LC3的功能而影响干细胞中细胞自噬小体的形成及其组装？关键要论证HULC怎样通过细胞自噬和P62的协同作用选择性地降解蛋白质或保护基因的表达？并对由此引发的相关基因功能的改变而诱发的干细胞恶性分化机制进行高通量分析。最终明确HULC基于细胞自噬对干细胞中的关键分子的表达动态性、信号通路网络、表观遗传修饰、核酸和蛋白质损伤修复能力、端粒寿命、细胞代谢的影响，以及由此促发的染色质重编程和染色质不稳定性的分子机制，从而揭示HULC基于细胞自噬调控干细胞恶性分化的重要功能及其意义。

本研究利用胚胎干细胞、诱导和分离的肝干细胞和肝癌干细胞、间充质干细胞，通过构建基因定点特异性插入过表达或RNA干扰的方法，建立过表达或敲除HULC的稳定细胞系和动物模型，探讨长链非编码RNA HULC促发细胞自噬调控人类干细胞恶性分化的机制。结果显示：1）揭示了HULC促发细胞自噬的表观遗传分子机制。发现HULC能够增强非组蛋白去乙酰化酶Sirt1的表达， 从而减少了自噬结构蛋白LC3的乙酰化修饰，并转化成活化型LC3-Ⅱ。进一步研究发现 HULC能够促进LC3II和ATG3的相互作用，促进了肝癌细胞中自噬小体的产生。2）发现HULC依赖miR675-HDAC5通路增加了肝癌干细胞细胞自噬产生，并通过自噬-PKM2途径增加人肝癌干细胞中的磷酸化pRB，CyclinD1,并抑制P21 WAF1 / CIP 1的表达。3）miR24-2通过减少蛋白精氨酸甲基化转移酶PRMT7而抑制了组蛋白H4精氨酸的甲基化修饰（H4R3me2和H4R3me3），从而促进了HULC的表达。miR24-2依赖HULC促进了Nanog的表达，并促进了人类肝癌干细胞中酪氨酸蛋白激酶肉瘤基因Src的表达。4）HULC介导CircMEG3抑制端粒合成酶H/ACA RNP的成员Cbf5表达，从而抑制人类肝癌干细胞端粒酶活性。5）HULC增强了POT1 、ExoI 、 TRF2 、 SNM1B 与端粒DNA的结合能力，促进了肝癌干细胞中端粒延长。6）miR-372依赖HULC促进YB-1磷酸化。7）HULC介导miR-26a-1促进了人类肝癌干细胞DNA损伤修复。8）发现PKM2依赖H3K4me3增强了HULC的转录，PKM2依赖HULC 激活肝癌细胞中β-catenin。 9） HULCeRNA-CircHULC增强了HULC和CircHULC的表达，并通过线粒体自噬增强PI3K的表达，激活AKT和mTOR。10）另外还发现， P62促发了间充质干细胞的恶性转化； miR-675与丙酮酸激酶M2协同促进肝癌干细胞生长；阻碍DNA错配修复加速间充质干细胞的恶性转化；揭示miR-155依赖磷酸化CDK2抑制了P21WAF1/CIP1的表达及其功能；miR-1307依赖内质网-蛋白折叠途径促进人类肝癌发生发展。这项研究揭示HULC可用作为人类肿瘤的治疗靶标，并为肿瘤临床诊疗研究提供了有价值的依据。