基于免疫结合和分子扩增介导的光电响应界面及河豚毒素检测研究

Tetrodotoxin (TTX) is the most toxic natural alkaloid neurotoxin that has ever been investigated. The simple and ultrasensitive detection of TTX is critical in food safety, as well as in the diagnosis of suspected patients suffered from TTX exposure. Based on our previous research on the photoelectrochemical sensing and its analysis application, we plan to ultrasensitively detect TTX by developing a photoelectrochemical immuno-analysis. To enhance the response of photoelectrochemical signal, the analytical technique based on Immuno-PCR will be introduced into the photoelectrochemical immuno-sensing process. As peptide nucleic acid (PNA) shows high salt and temperature tolerance when it hybrids with DNA, the amplified DNA is designed to mediate the interface self-assembly of PNA-QDs on AuNP deposited electrode, resulting in a high efficiency and stability on the photoelectrochemical sensing surface.To improve the sensitivity in Immuno-recognition, the magnetic bead will be utilized for the isolation of TTX-antibody complex. Furthermore, the noncompetitive immuno-analysis on the photoelectrochemical interface would be established, which could obviously decrease the limit of detection of the photoelectrochemical sensing method. To avoid using of temperature controller instrument during PCR, the recombinase polymerase amplification is expected to be examined for molecule amplification. Finally, the immuno-RPA photoelectrochemical technology is explored for the detection of TTX in femtomolar level with ultra-sensitivity and simplicity.

河豚毒素（TTX）是已知毒性最强的小分子天然生物碱类神经毒素，针对其开发简易、超灵敏的检测方法对食品质量安全和对疑似中毒患者诊断都具有重要意义。申请人拟基于在光电化学界面分析的研究基础，探索光电化学免疫传感界面对TTX的超灵敏分析方法。为增强响应信号，将免疫PCR分析技术引入光电化学免疫传感分析，并利用肽核酸（PNA）与DNA杂交时高盐度与温度的耐受性，以扩增的DNA介导PNA修饰的量子点在沉积纳米金的电极上进行组装，构建高效稳定的光电化学响应界面；为大幅提高界面免疫反应的灵敏度，以磁珠分离TTX-抗体复合物，构建光电化学界面上非竞争型免疫识别方法；以重组酶聚合酶扩增反应（RPA）实现常温下DNA的扩增，摆脱对控温仪器的依赖；最终形成免疫RPA的光电化学检测方法，实现对飞摩尔水平上的TTX的简易、超灵敏检测。

河豚毒素（TTX）是已知毒性最强的小分子天然生物碱类神经毒素，该毒素常存在于河豚鱼等海洋生物中，在食用鲜河豚鱼及其鱼干制品时，如宰杀或加工不当，很容易造成 TTX 残留，严重威胁公众生命安全。针对其开发简易、超灵敏的检测方法对食品质量安全和对疑似中毒患者诊断都具有重要意义。电化学免疫传感器具有成本低、制备简易、易于携带、操作方便等优点，在TTX的便携式现场快速检测技术开发中具有很好的应用前景。壳聚糖和Nafion化学性能稳定，分别为正电性和负电性高分子，易于在界面成膜、且具有良好的离子通透性，在传感器制备中具有广泛应用。.本课题探索了TTX电化学免疫传感器的制备过程的抗原组装问题。通过制备TTX免疫抗原，探索其在电极界面上进行组装的性能。以壳聚糖和Nafion分别辅助抗原在电极表面的固定，并通过纳米金的界面对抗原吸附增加电极界面的导电性能。通过竞争免疫检测策略，特异结合TTX抗体后，修饰电极界面对溶液中的电活性物质（铁氰化钾或三联吡啶钌）产生了差异性的电化学相应，从而构建了对溶液中TTX的检测电化学免疫传感器。与传统电化学免疫传感器不同，该传感器无需酶标过程，直接进行电化学检测。另外，以壳聚糖和Nafion辅助的界面组装实现了传感器界面的稳定组装和响应，使得传感器的制备具有简易、质量稳定的特点。.不仅如此，为实现现场自动化的检测的需求，本课题基于电浸润原理制备数字微流控平台，研究了其用于液滴控制以及检测应用的可行性，并以亚硝酸自动化比色检测验证了其应用前景。相对于传统的微通道模式微流控器件，该平台具有体积小、成本低、制作简易、稳定性高、操作简单、自动化、灵活性等优点。在便携式、自动化、快速、现场检测器件的应用方法开发中具有明显的应用价值。未来研究中，本课题将把数字微流控检测平台与电化学检测模式整合，实现TTX的数字微流控平台上自动化检测过程。