一种新颖的基因缺陷型EV71活疫苗的研究

EV71病毒感染可引起无菌脑膜炎、小脑脑炎及急性肌肉无力麻痹等神经系统并发症，其神经细胞毒性是引起婴幼儿重症手足口病死亡的重要病因，目前尚无有效药物和疫苗。在本项目中，我们将依据EV71 复制及包装的原理，利用慢病毒系统构建能稳定表达P1蛋白转化Vero细胞系；利用反向遗传学和基因重组技术构建基因缺失型EV71复制子；将该复制子转化到稳定表达P1蛋白的细胞系后，获得能在转化细胞内无限复制而在非转化细胞内一次性感染的P1基因缺陷型的EV71病毒。通过细胞学实验，确定该病毒在细胞内复制特性；通过动物免疫实验，检测血液中和不同组织中细胞因子、炎症因子和中和保护抗体，确定该病毒诱导中和抗体和各种细胞因子的效果；通过临床症状观察，病理切片，不同组织内病毒含量的定量检测，确定其作为疫苗的安全性。探讨一种有别于传统疫苗产生的活疫苗产生的新模式，提供一种安全，高效、能规模化生产的新型EV71疫苗技术平台。

成功构建稳定表达EV71多聚蛋白的稳定表达细胞系和缺失P1结构基因的EV71基因组复制子。在此基础上，将EV71 P1基因缺失型复制子转染到稳定表达P1多聚蛋白的Vero细胞系。由复制子提供的3CD蛋白酶将P1多聚蛋白切割成形成VP1、VP2、VP3、VP4，再通过2C与VP3的相互作用，包装重组型复制子形成基因缺陷型病毒颗粒。同时依据相同的原理，利用杆状病毒Bac-to-bac表达系统构建成的分别表达EV71 P1和3CD蛋白的重组杆状病毒，共同感染昆虫细胞后能够包装成病毒样颗粒，共表达P1和3CD蛋白也能包装病毒样颗粒。免疫实验证明该EV71 VLP能在小鼠体内诱导高滴度的中和抗体，并利用EV71 VLP作为抗原筛选到7株单克隆抗体，组建了EV71临床检测试剂盒。此外，成功构建了高效产生EV71和CVA16 嵌合疫苗重组杆状病毒系统，获得高纯度的EV71和CVA16嵌合的VLP。